DAPK1介导老化过程中学习记忆损伤的分子机制研究

发布时间：2020-04-24 08:42

【摘要】：【背景】衰老是指生物体对环境的生理和心理适应能力进行性降低并逐渐趋向死亡的现象。衰老可分为两种类型:生理性衰老和病理性衰老。生理性衰老是指成熟期后出现的生理性退化过程,而病理性衰老是由于各种外来因素(包括各种疾病)所导致的老年性变化。在生理性衰老过程中,人们会产生睡眠,认知,社会活动等方面的障碍。而学习记忆能力减退是大脑老化认知功能障碍的表现之一,且衰老相关的学习记忆能力受损的机制并不明确。我们早期的研究发现DAPK1参与了阿尔兹海默症中的空间学习记忆损伤,但是其分子机制还不清楚。已知Caytaxin在海马神经元突触前高丰度表达,并参与谷氨酸等神经递质的合成和运输。但是,在大脑老化过程中,DAPK1是如何参与学习记忆的调控,我们还不清楚。根据我们前期实验结果发现,在小鼠老化的大脑中,DAPK1的活性增加,并且Caytaxin的表达与DAPK1的活性有关。因此我们提出问题,在大脑老化过程中,DAPK1是否参与学习记忆的损伤。【目的】(1)明确DAPK1是否参与老化过程中学习记忆的损伤;(2)寻找DAPK1参与老化过程中学习记忆的损伤的分子机制。(3)通过转基因的手段选择性敲除兴奋性神经元中DAPK1的激酶域来探讨延缓衰老的有效策略。【方法】首先我们根据小鼠与人类年龄对应信息,选择4月龄(年轻组)、18月龄(老龄组),分别选用C57BL/6J小鼠,DAPK1-KD~(loxp/loxp)和CaMK2α-cre小鼠作为研究对象,通过一系列行为学实验来检测小鼠的空间学习记忆和恐惧记忆;通过免疫印迹(Western blot)的方式来检测老龄组小鼠海马是否发生衰老(p16/p53衰老相关指标)和DAPK1的活性(pDAPK1/pMLC),caspase3的激活(cleaved caspase3)及Caytaxin的表达;通过D-galactose建立体外培养神经元的衰老模型,通过免疫印迹的方式检测Caytaxin的蛋白水平;通过免疫荧光的方法观察老龄组小鼠海马亚结构DG中Caytaxin的表达变化;利用D-galactose诱导原代神经元细胞衰老,加入DAPK1抑制剂HS38和caspase3的抑制剂z-VAD-fmk,通过免疫印迹的方式检测Caytaxin的表达;在HEK293T细胞构建表达体系,转染DAPK1的突变体(失活型DAPK1-K42A和持续激活型DAPK1-ΔCaM),并加入caspase3的抑制剂z-VAD-fmk,通过免疫印迹的方式检测Caytaxin的表达;利用慢病毒抑制海马Caytaxin表达,通过一系列行为学实验来检测小鼠的空间学习记忆和恐惧记忆。【结果】1.衰老过程中,Caytaxin蛋白的减少与DAPK1激活相关检测4/18月龄小鼠的行为,发现老龄鼠空间学习记忆受损,海马相关恐惧记忆受损。分别检测4、8、12、18个月的C57小鼠海马组织,WB显示DAPK1、Caspase3活性上调,Caytaxin表达量下调,p53/p16等衰老相关基因表达上调,而DAPK1表达量未见明显变化;衰老的神经元模型(D-gal)中检测到DAPK1、Caspase3活性上调,Caytaxin表达量下调,p53/p16等衰老相关基因表达上调。2.沉默Caytaxin可以降低神经元的兴奋性,损伤学习记忆原代神经元过表达/沉默Caytaxin,检测mEPSC,沉默Caytaxin组的突触功能减退;在海马齿状回区域(DG)注射过表达/沉默Caytaxin的慢病毒,对各组小鼠进行电生理和行为学检测,结果显示沉默Caytaxin组CA3-CA1的长时程增强损伤,空间学习能力下降,海马相关情景恐惧记忆受损。3.DAPK1通过激活caspase3降解Caytaxin在D-galactose诱导的衰老的原代神经元中,加入HS38或z-VAD-fmk都可以恢复Caytaxin的表达;在HEK293T细胞中,激活DAPK1组加入z-VAD-fmk后可以恢复Caytaxin的表达。4.敲除DAPK1激酶域上调海马Caytaxin表达我们构建DAPK1激酶域敲除小鼠,并将动物分为四组,4月龄的DAPK1-KD~(-/-)小鼠和DAPK1-KD~(loxp/loxp)小鼠,18月龄的DAPK1-KD~(-/-)小鼠和DAPK1-KD~(loxp/loxp)小鼠。DAPK1-KD~(-/-)老龄鼠海马组织WB检测显示,与DAPK1-KD~(loxp/loxp)老龄鼠相比,caspase3活性下调,Caytaxin表达量上调,p53/p16等衰老相关基因表达下调;免疫组化检测显示,老龄鼠DG的Caytaxin表达显著下调,DAPK1-KD~(-/-)老龄鼠DG的Caytaxin表达较DAPK1-KD~(loxp/loxp)老龄鼠明显增加。5.敲除DAPK1激酶域可以改善衰老所致的学习记忆损伤电生理结果显示,DAPK1-KD~(loxp/loxp)老龄鼠的LTP难以诱发和维持,而DAPK1-KD~(-/-)老龄鼠的LTP的诱发和维持与成年鼠并无明显差异。水迷宫结果显示DAPK1-KD~(-/-)小鼠空间学习能力显著提高,并且恢复到与4月龄的DAPK1-KD~(loxp/loxp)小鼠相似的水平;情景恐惧实验结果表明敲除小鼠海马中DAPK1激酶域能改善由衰老所致的恐惧记忆损伤。【结论】在老龄鼠中,小鼠海马细胞发生衰老,DAPK1活性增加,通过激活caspase3,使Caytaxin表达减少,导致空间学习记忆功能受损,在兴奋性神经元中特异性敲除DAPK1的激酶域通过上调海马Caytaxin的表达改善衰老过程中空间学习记忆能力受损。
【图文】：

图 1. 衰老过程中 Caytaxin 蛋白的减少与 DAPK1 激活相关。A. 老龄小鼠在 Morris 水迷宫隐藏平台训练中表现异常。到达平台的潜伏期。B. 探索实验时小鼠穿越平台区域的次数和在目标象限滞留时间的百分比。每组 n=15，，*P<0.05。C.D. 恐惧实验中关联条件恐惧检测和暗示条件恐惧检测中

图 2.沉默 Caytaxin 降低神经元的兴奋性，损伤学习记忆。A. 培养的原代海马神经元（DIV15）表达 GFP，Caytaxin 和 si-Caytaxin。B.Westernblot 检测表达GFP，Caytaxin和si-Caytaxin 的培养的原代海马神经元中Caytaxin，
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363

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本文编号：2638759