血管基底膜对内皮细胞NFκB信号通路的调控作用及机制研究

发布时间：2020-04-27 15:56

【摘要】：研究背景及目的:内皮细胞(endothelial cells,EC)NF-кB信号在败血症、动脉粥样硬化等炎症相关疾病的发生、发展中发挥重要作用。内皮细胞坐落于由多种生物大分子组成的基底膜(basement membrane,BM)之上。尽管过往有大量文献报道了基底膜各单一组分或基底膜替代物(如Matrigel)对EC生物学功能的调控作用,但这些体外基底膜研究模型在化学成分和/或物理性状方面均与真正基底膜存在显著差异,而来源于体内、保存了基底膜真实性和完整性的羊膜或肠系膜基底膜体外研究模型被长期忽视,目前仍缺乏关于基底膜作为整体是否以及如何调节EC功能的研究。基于非炎性状态下内皮细胞具有完整的基底膜而炎症状态下的毛细血管内皮细胞失去基底膜完整性这一体内观察结果,我们利用来源于肠系膜的基底膜体外研究模型,探讨了基底膜作为一个整体调控内皮细胞炎症信号的可能性。在观察到完整基底膜在体外抑制内皮细胞NFκB炎症信号的同时增强内皮细胞间粘附的结果后,我们对其分子机制展开了深入研究,并利用Lox P-Cre技术试图建立血管选择性的体内基底膜基因敲除小鼠模型,为后继体内研究基底膜完整性对内皮细胞NFκB炎症信号的调控作用提供动物模型。研究方法:(1)从活体大鼠体内获取大网膜,制备保持基底膜完整性和真实性的基底膜模型。(2)利用蛋白免疫印迹(Western Blot)、RT-PCR、NFкB荧光素酶报道基因等技术,研究NFκB信号活化程度差异及相关蛋白表达。(3)利用高盐洗脱、激活白细胞孵育等方法破坏基底膜完整性,研究基底膜完整性对内皮细胞NFκB信号的影响。(4)利用重组慢病毒介导的sh RNA静默VE-Cadherin表达以及不同细胞培养密度研究VE-Cadherin介导的细胞间粘附对内皮细胞NFκB信号的影响。(5)利用荧光素酶报道基因与Western Blot等技术研究基底膜通过调控VECadherin表达进而调控β-Catenin转录活性及β-Trcp1表达水平,从而调控IκB表达水平及NFκB信号。(6)利用GST融合蛋白下拉(pulldown)技术研究VE-Cadherin对Rho A小GTPase活性的影响,进而利用基因点突变技术研究Rho A活性对NFкB活性的影响。(7)利用VE-Cadherin-Cre/Lox P技术建立血管基底膜组织特异性Laminin-γ1基因敲除小鼠品系,为研究血管基底膜完整性对NFκB信号的影响提供动物模型。研究结果:(1)从体内分离出来的大网膜基底膜组织能够抑制内皮细胞NFκB信号通路;(2)基底膜的完整性对抑制内皮细胞NFκB信号至关重要;(3)完整基底膜通过增强内皮细胞VE-Cadherin介导的细胞间粘附抑制NFκB信号;(4)VE-Cadherin能够抑制β-Catenin转录活性而降低β-TRCP1表达,β-TRCP1调控底物IκB蛋白质稳定性升高,最终抑制NFκB信号;(5)VE-Cadherin能够降低Rho A活性,进而抑制下游NFκB信号。研究结论:完整基底膜在体外抑制内皮细胞NFκB信号,此抑制作用通过VECadherin介导的细胞间粘附进而调控β-catenin转录活性以及Rho A活性而实现。
【图文】：

信号机制,基底膜,内皮细胞,稳定提高

其下游的NF κB表达；另一方面VE-Cadherin抑制与其胞内段结合的分子β-Catenin进入胞核，减弱β-Catenin对CRD-BP的稳定作用，导致β-TRCP1表达减少，使得I κBα稳定提高，最终抑制了NF κB信号。如图1所示。图1基底膜调控内皮细胞NF κB信号机制的猜想Figure 1 Conjecture of the basement membrane regulating the signaling mechanism of NF κB inendothelial cells

示意图,基底膜,示意图,小鼠

图 3 基底膜 Transwell 培养示意图Figure 3 Schematic diagram of basement membrane Transwell culture3.2.2 HUVEC 细胞的获得与培养HUVEC 细胞通过胶原酶消化的方式，由江苏大学附属医院妇产科提供的鲜脐带中分离而获得。培养基成分为培养基 199（Gibco），并含 20％人血清50μg/ mL 内皮细胞生长补充物（BDBiosciences），100U/mL 青霉素和 100μg链霉素成分。并用生长因子混合物刺激，包括 100 ng / mL 人血管内皮生长因（VEGF），50 ng / mL 人肝细胞生长因子（HGF），10ng / mL 人 TGFβ，0.5mLTGFβ1 和 100μg/ mL 肝素。3.2.3 小鼠的繁殖与鉴定（1）小鼠的获得LamC1 fl/+ 小鼠购于美国 The Jackson Laboratory，委托南京大学模式动研究所代为进口，该小鼠已被成功用于基底膜对神经系统功能影响的研究,品
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R363

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