HGF基因修饰的牙髓间充质干细胞对双侧卵巢切除诱导的骨质疏松模型早期骨量减少的保护作用及机制研究

发布时间：2020-04-29 03:41

【摘要】：细胞治疗作为一种新型的治疗手段,目前已应用于多种疾病,全球范围已有十余种干细胞产品上市,应用前景广阔。骨质疏松是最常见的一种骨疾病,其发生是由于破骨细胞的活性远远高于成骨细胞活性而导致的骨吸收与骨生成不匹配,最终导致骨量减少。目前治疗的主要策略是抑制破骨细胞的过度激活从而减少骨量持续减少。课题组前期研究发现牙髓来源间充质干细胞具有非常强的成骨能力。HGF是一种具有促进细胞存活、组织再生,抑制并改善慢性炎症和纤维化,促进成骨细胞增殖,参与骨重塑的多功能细胞因子。因此,本实验在此基础上,对牙髓间充质干细胞进行肝细胞生长因子(HGF)基因修饰,评价其对骨质疏松的治疗作用,并揭示其治疗机制。首先,我们建立了牙髓间充质干细胞(DPSCs)获取、培养、鉴定、储存等一系列的标准化操作规程,为DPSCs作为一种可靠的细胞治疗产品提供了保障。同时我们比较了骨髓、脐带、脂肪和牙髓这四种来源间充质干细胞的成骨能力。利用实时荧光定量PCR的方法,从mRNA水平,观察到成骨相关基因alp、runx2和oc在骨髓和牙髓来源的间充质干细胞中高表达。我们扩增并纯化了携带HGF的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-HGF),用其感染DPSCs(DPSCs-HGF),在不影响DPSCs生物学特性的条件下,使DPSCs能够分泌大量的HGF蛋白。通过荧光定量PCR和Western Blot的方法,验证了经过HGF基因修饰的DPSCs,其ALP、RUNX2和OC等成骨相关基因在mRNA和蛋白水平表达都显著增加。为了观察细胞给予小鼠后在小鼠体内的分布规律,我们构建了表达荧光素酶的重组腺病毒(Ad-Luc)。用Ad-Luc感染DPSCs(DPSCs-Luc),通过尾静脉注射的方法将细胞移植到小鼠体内,运用小动物活体成像系统,发现其早期分布在肺脏,后期逐渐转移到肝脏,并在肝脏持续存在超过一个月。整个观察期未明显观察到细胞归巢至骨量缺失处。在观察终点,我们处死小鼠,将各器官取出,分别用小动物活体成像系统检测,进一步证实细胞主要分布于肝脏,且仍未观察到股骨内有细胞分布。另外,我们还比较了细胞移植时机对于细胞在小鼠体内分布的影响。我们选取的细胞移植时间分别是建立小鼠骨质疏松模型后一天和一个月,经尾静脉注射DPSCs-Luc。通过比较两组间荧光强度的强弱来间接比较不同时机进行DPSCs干预,细胞在小鼠体内存活量的差别。结果发现,与造模后一个月给予细胞组相比,在造模后一天给予细胞治疗,其在小鼠体内荧光表达强度更强。上述结果提示,为获得更佳的治疗效果,应在造模后早期使用细胞治疗。考虑到人来源的DPSCs在小鼠肝脏的长期存活可能影响其肝功能,我们还检测了小鼠血清中的AST和ALT的表达水平,发现人源DPSCs-Null和DPSCs-HGF在小鼠肝脏存活6周并未影响小鼠的肝功能。其次,我们利用双侧卵巢切除的方法,建立了小鼠骨质疏松模型。在C57BL/6小鼠卵巢切除一个月后,利用高分辨CT(μCT)评价小鼠股骨远端骨小梁(松质骨)的骨量情况,发现经过双侧卵巢切除术后,小鼠骨小梁的骨量显著降低,而股骨的硬质骨骨量变化不明显,因此本实验采用小鼠股骨的骨小梁骨量作为变化指标,评价DPSCs治疗骨质疏松的效果。在小鼠双侧卵巢切除后一天,经尾静脉注射DPSCs-HGF,给予细胞后一个月,发现细胞治疗可显著改善小鼠的骨量减少,其中骨小梁骨量占总空间比升高约23%,骨小梁骨密度升高约22%。与模型组相比,对照病毒Ad-Null感染的DPSCs(DPSCs-Null)治疗组,骨量减少虽有缓解,但二者之间无统计学差异。因此我们延长了疗效观察时间,发现在细胞治疗后6周,DPSC-Null治疗组与模型组相比,其骨量减少具有统计学差异。基于以上实验结果,我们认为采用DSPCs治疗骨质疏松,适宜在骨质疏松早期进行细胞干预,且DPSC-HGF具有更好的治疗骨质疏松作用。本研究我们发现注射到体内的细胞并没有分布到骨量减少的股骨局部,表明治疗效果并不是由于外源间充质干细胞本身向骨量减少部位迁移并分化为成骨细胞,而有可能是通过间充质干细胞的旁分泌作用来发挥炎症抑制和促进成骨的作用。因此我们又进一步开展了DPSCs治疗骨质疏松机制的研究。我们利用Luminex多因子检测技术,检测了模型组及细胞治疗组小鼠不同时间点血清中RANKL、OPG、IL-6和TNF-α等因子表达量的动态变化,发现模型组小鼠与假手术组正常小鼠相比,其血清中RANKL显著增加,且OPG逐渐降低。而通过给模型小鼠进行细胞治疗,能够抑制RANKL/OPG途径,从而减少骨质疏松小鼠的骨量丢失。模型组小鼠与假手术组正常小鼠相比,其血清中IL-6和TNF-α表达增高,通过给模型小鼠进行细胞治疗,能够抑制IL-6和TNF-α的增高,从而在一定程度抑制骨质疏松小鼠的炎症反应。同时我们还分离培养了细胞治疗6周后小鼠的骨髓间充质干细胞,应用荧光定量PCR和Western Blot的方法,发现模型小鼠骨髓间充质干细胞成骨相关基因及蛋白ALP、RUNX2、OC均显著降低,经过细胞治疗后,其下降程度得到缓解。最后,考虑到DPSCs改善骨量减少的主要作用可能是通过其分泌的活性物质,因此我们又探索了DPSCs的衍生物即DPSCs来源的外泌体,并对其特性及其干预骨质疏松的可能作用进行了研究。我们采用超速离心的方法,分离提纯了DPSCs-Null和DPSCs-HGF来源的外泌体,利用透射电子显微镜观察到其具有外泌体的典型形态,利用粒径分析统计证明外泌体的粒径大小分布在100nm左右,利用流式细胞仪验证了所提取外泌体具有典型的与内吞体分选转运体相关的蛋白CD9、CD63和CD81,同时表达与其来源DPSC相同的表面标志,CD73、CD90、CD105表达阳性,CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR表达阴性。利用外泌体与DPSCs共培养,验证了其具有促进细胞向成骨分化的作用,这为后期利用外泌体治疗骨质疏松奠定了基础。综上所述,我们通过规范牙髓间充质干细胞获取、培养、鉴定等流程,为其作为一种细胞治疗产品提供了可能。我们创新性地用HGF基因修饰DPSCs,通过增强DPSC的成骨能力和炎症抑制作用来增强DPSCs在骨质疏松模型中的疗效,并且初步探索了DPSCs-HGF来源的外泌体对DPSCs成骨分化相关基因的影响。实验结果提示,DPSCs发挥治疗骨质疏松的作用主要是通过其分泌细胞因子,影响RANKL/OPG途径,减少炎症因子激活,减轻小鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的损害程度,最终抑制小鼠的骨量缺失。上述研究为临床上治疗骨质疏松提供了新思路和理论基础。
【图文】：

间充质干细胞,细胞,表面标志,标志物

图 1 人牙髓间充质干细胞形态观察A 为 P0 代细胞，，B 为 P3 代细胞3.2 DPSCs 表面标志物鉴定收集第 3 代 DPSCs，流式细胞仪收集数据后，通过 FlowJo7.6 软件分析细胞免疫表型（图 2），结果显示，图 2B、2C 为小鼠 IgG1 FITC、IgG1 PE 图示。表面标志物 CD73、CD90、CD105 为阳性（图 2D、E、F），B 淋巴细胞表面标志物 CD19（图 2G）、造血祖细胞表面标志物 CD34（图 2H）、单核细胞/巨噬细胞粒细胞等表面标志物 CD11b（图 2I）、淋巴细胞表面标志物 CD45（图 2J）、抗原提成细胞表面标志物 HLA-DR 为阴性（图 2K）。该结果表明，从牙髓分离的细胞，经培养后无造血细胞、淋巴细胞混杂，其表面标志物的表达符合间充质干细胞的特性。

表面标志,小鼠,细胞表型,流式细胞仪分析

图 2 流式细胞仪分析 DPSC 细胞表型特征析的细胞，B 图为小鼠 IgG1 FTTC，C 图为小鼠 E 图为表面标志物 CD90，F 图为表面标志物 CD 图为表面标志物 CD34，I 图为表面标志物 CD11物 CD45，K 图为表面标志物 HLA-DR化PSCs 经成骨诱导分化后，出现黑色的矿化结节
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R580;R-332

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