AT1R-β-arrestin信号转导复合物对激素急性分泌的调控及机制

发布时间：2020-05-01 12:45

【摘要】：G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)是目前已知的种类最多的膜蛋白受体,其家族成员有800多种,占基因组编码的3%左右。GPCR广泛分布于各个组织和器官中,参与调控机体的感知、生长、发育、代谢和内分泌等几乎所有的生命活动。例如,视紫红质可以感受光线,嗅觉受体识别不同的气味分子,血管紧张素受体参与调节血压,趋化因子受体调控机体的免疫反应,脂肪酸受体参与调控代谢过程等等。GPCR对于维持生物体的正常生理平衡起着关键作用,它的功能异常会直接或间接的影响机体的健康状态,并导致一些重大疾病的发生,如糖尿病、心脏病、帕金森病以及哮喘等。据统计,目前市场上的临床药物中约有33%是直接作用于GPCR,世界前200个最畅销药物中有1/10是以GPCR作为药物靶点。其中著名的药物包括氯沙坦,心得安,雷尼替丁,替加色罗等。因此对于GPCR的研究具有非常重要的临床意义和应用价值,相关的基础研究已经获得过10次诺贝尔奖。GPCR被来自细胞外界的配体激活后所引起的激素急性分泌在机体内的许多生理过程中都发挥着重要作用。一般认为GPCR被激活后,主要是通过下游的G蛋白和β-arrestin这两类效应分子来行使其信号转导的功能。传统的研究观点认为,G蛋白介导的受体信号转导是较为迅速的,主要定位在细胞膜上,其发生时间在几秒到几分钟之内,因此称之为第一波信号途径;而β-arrestin介导的受体功能与G蛋白途径相比较慢,是在其和受体的信号转导复合物进入到内质网之后开始的,一般发生在几分钟以后,因此被称为第二波信号途径。例如,乙酰胆碱受体M2R被激活后,可以通过下游的G蛋白亚基GβY,直接作用在GIRK(G protein-gated K+ channel)上,从而迅速引起通道的开放。然而p-arrestin信号途径则无法快速的激活离子通道,引发急性的生理效应。血管紧张素受体AT1R(Angiotensin II receptor type 1)是临床上治疗心血管疾病,如高血压和心力衰竭的重要药物靶点之一。我们在对AT1R的研究中发现,当它被β-arrestin偏向性的配体TRV120027激活后,可以通过AT1 R-β-arrestin1信号转导复合物招募 PLCγ1(Phospholipase C-γ1)和 TRPC3(Transient receptor potential channel 3),使得细胞膜上的离子通道TRPC3的构象转变为激活态,通道开放导致细胞外的钙离子内流进入胞内,进而引起儿茶酚胺类激素如肾上腺素和去甲肾上腺素的急性分泌。并且我们进一步的实验结果表明,GPCR-β-arrestin-1-TRPC3这一快速的信号转导机制,不仅适用于受体AT1R,对于M型乙酰胆碱受体在生理及病理条件下的功能维持也起着重要的作用,提示我们这一机制对于GPCR可能具有普适性。我们的这一发现打破了 β-arrestin只能介导GPCR的第二波信号途径这一固有认知,首次证实GPCR可以通过β-arrestin-1途径来发挥第一波信号转导效应,为以后研究GPCR的偏向性药理学性质拓宽了基础。同时,这一研究揭示了 GPCR激活离子通道的一个全新机制,即受体可以通过β-arrestin途径快速激活细胞膜上的离子通道,这也为相关的药物研发提供了新的理论依据。此外,我们发现了 TRV120027作为三期临床药物的潜在副作用,并提出了改善的方法。即TRV120027可以通过β-arrestin-1途径促进肾上腺素的急性分泌,这对于临床治疗高血压和心衰是不利的,但如果联合TRV120027和我们新发现的抑制β-arrestin-1活力的多聚Pro短肽使用,则既保证了 TRV120027好的治疗效果,又可以消除它引起激素分泌的这一潜在副作用,为临床上相关心血管疾病的治疗提供了进一步指导。研究目的AT1R的偏向性配体可以通过选择性的激活下游不同的信号途径从而产生不同的生理效应。一些研究结果表明,针对AT1R-β-arrestin信号途径的偏向性配体对治疗高血压以及心衰,要比传统的拮抗剂氯沙坦具有更好的疗效。然而AT1R被内源性的配体如AngⅡ所激活后,引发的肾上腺素和去甲肾上腺素分泌对于心血管疾病的治疗是不利的。目前AT1R的β-arrestin偏向性配体TRV120027已进入三期临床阶段,本课题的主要目的在于研究AT1R被β-arrestin偏向性配体激活后其下游的信号转导途径以及对激素分泌的影响。研究方法涉及到的主要研究方法如下:1.利用碳纤电极检测小鼠肾上腺髓质来源的原代嗜铬细胞中儿茶酚胺类物质的分泌。2.通过ELISA的实验方法检测细胞内的IP1含量以及小鼠肾上腺髓质的相关激素的分泌。3.通过钙成像的方法检测细胞内游离的钙离子浓度。4.利用免疫荧光技术检测AT1R β-arrestin-1,TRPC3三者之间的共定位情况。5.通过免疫共沉淀(Co-IP)实验检测AT1R,β-arrestin-1,TRPC3以及PLCγ1之间的相互作用。6.通过生物共振能量转移(BRET)实验检测AT1R对下游β-arrestin的招募情况以及β-arrestin和TRPC3之间的相互作用。7.通过GST pull down实验体外检测β-arrestin-1与PLCγ1-SH3蛋白的相互作用。8.统计学分析:本研究中的所有实验统计数据以均值±标准差的形式展示,并采用了GraphPad Prism 7软件进行相关的统计学分析,当p0.05时认为二者具有显著性差异。研究结果1.AT1R的β-arrestin偏向性配体可以引起原代嗜铬细胞的激素急性分泌。我们采用从小鼠肾上腺髓质分离出来的原代嗜铬细胞进行实验,分别给予不同的AT1R配体刺激。实验结果表明,不仅Gq偏向性的配体可以引起嗜铬细胞迅速分泌儿茶酚胺类激素,如肾上腺素和去甲肾上腺素。β-arrestin偏向性的配体,如TRV120027也可以引起激素的急性分泌。2.AT1R被β-arrestin偏向性配体激活后,主要是通过β-arrestin-1途径引起嗜铬细胞的激素分泌。我们采用了G句敲除小鼠,β-arrestin-1敲除小鼠以及β-arrestin-2敲除小鼠进行实验。发现敲除Gq或者β-arrestin-2后,都不会影响到β-arrestin偏向性配体b6所引起的激素分泌。但是将β-arrestin-1敲除后,使用β-arrestin偏向性的配体,如TRV120027进行刺激时,无法检测到分泌。表明在此过程中,AT1R被偏向性配体激活后主要是通过β-arrestin-1途径引起激素的急性分泌。3.β-arrestin-1途径引起的激素分泌主要是通过细胞外钙离子的内流实现的。为了检测β-arrestin-1途径引起激素分泌的过程中,细胞内钙离子的来源,我们将实验过程中的细胞外环境换成了无Ca2+溶液。实验结果显示,在细胞外韦钙离子缺失的情况下,即使给予β-arrestin偏向性的配体TRV120027刺激,也无法检测到分泌。表明β-arrestin-1途径介导的激素分泌,主要是通过细胞外钙离子流入胞内才得以实现。4.β-arrestin-1途径可以激活细胞膜上的离子通道TRPC3。细胞外的钙离子一般需要通过细胞膜上的离子通道流入胞内。为了继续研究在这一过程中,细胞膜上有哪些离子通道发挥作用从而引起的钙内流,我们使用了不同的离子通道抑制剂进行实验。实验结果显示,将细胞膜上的离子通道TRPC3特异性阻断后,使用β-arrestin偏向性配体TRV120027进行刺激,此时无法检测到细胞内的钙信号变化。表明β-arrestin-1途径可能是通过激活细胞膜上的离子通道TRPC3导致胞外钙离子流入胞内,从而引起激素的分泌。5.β-arrestin-1可以与TRPC3发生相互作用。为了研究究p-arrestin-1是如何激活细胞膜上的TRPC3,我们首先通过免疫荧光实验检测二者是否发生相互作用。实验结果表明,在使用偏向性配体TRV120027激活AT1R后,β-arrestin-1和细胞膜上的TRPC3有着明显的共定位。进一步的,我们通过细胞内免疫共沉淀(Co-IP)实验以及生物发光共振能量转移(BRET)实验,证明了 TRV120027激活AT1R后,下游招募的β-arrestin-1可以与细胞膜上的TRPC3发生相互作用。6.AT1R/β-arrestin-1/TRPC3可以形成复合物,调控细胞内的钙离子浓度。我们通过实验发现AT1R和TRPC3之间也存在相互作用,推测三者可能是形成AT11R/β-arrestin-1/TRPC3这样一个三级复合物发挥作用。我们在HEK293细胞内共表达这3种蛋白,给予配体TRV120027刺激,发现可以检测到细胞内钙信号的升高。并且使用TRPC3的特异性抑制剂PYR3可以阻断钙信号的升高。这一结果表明,正是AT11R/β-arrestin-1/TRPC3的共同作用,调控细胞内的钙离子浓度变化。7.PLCγ1可以参与复合物形成并影响其正常功能。之前有研究表明PLCγ1对于TRPC3的激活是非常关键的。为了研究PLCγ1是否有参与到这一调控过程中,我们进行了相关的Co-IP以及GST-pull down实验。实验结果显示β-arrestin-1是可以和PLCγ1发生直接相互作用的,表明PLCγ1可以参与到AT1R/β-arrestin-1/TRPC3复合物的形成过程。并且使用特异的多聚Pro短肽阻断β-arrestin-1和PLCγ1的相互作用后,会影响到复合物的正常功能,使得TRV120027所引起的TRPC3激活受到抑制,导致嗜铬细胞的分泌水平降低。8.GPCR/β-arrestin-1/TRPC3调控激素分泌的机制具有普适性。为了探究β-arrestin-1/TRPC3这一机制,是特异性的针对AT1R发挥作用,还是一个具有普遍意义的机制。我们采用了一系列的GPCR激动剂来进行实验,包括乙酰胆碱(Acetyl-β-methylcholine,MCh),胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)以及缩宫素(Oxytocin,OT),分别检测这些激动剂所引起的嗜铬细胞分泌是否会被TRPC3的特异性抑制剂所阻断。实验结果显示,抑制TRPC3的活性后,乙酰胆碱受体介导的激素分泌显著降低。进一步的,在采用β-arrestin-1敲除鼠进行实验时,MCh刺激后引起的嗜铬细胞分泌与对照小鼠相比显著降低。表明β-arrestin-1/TRPC3调控激素分泌的这一信号途径,对于乙酰胆碱受体也是适用的,提示我们这一调控机制对于GPCR而言可能是具有普适性的。
【图文】：

配体,过表达,信号途径,对照组

刺激过表达ＡＴＩＲ的ＨＥＫ２９３细胞后，均可以检测到细胞内的ＩＰ１含量显著升高；逡逑而当使用邋Ｓ邋ｎ邋（１邋｜ＩＭ），邋ＴＲＶ１２００２６邋（１邋｜ｉＭ）以及邋ＴＲＶ１２００２７邋（１００邋ｎＭ）刺激过表达逡逑ＡＴ１Ｒ的细胞时，其ＩＰ１水平与对照组相比没有明显的变化（图１）。实验结果表逡逑明配体Ａｎｇ邋ｎ，ＴＲＶ１２００５５以及ＴＲＶ１２００５６均可以激活ＡＴ１Ｒ下游的Ｇｑ信号途逡逑径。而Ｓ邋ＩＩ，ＴＲＶ１２００２６以及ＴＲＶ１２００２７则无法激活下游的Ｇｑ信号途径。逡逑３０逡逑＊＊逡逑＿邋Ｊ；邋＊＊逡逑１２０－逡逑■邋■逡逑Ｓ逦ｎ．ｓ．逡逑￡：ｉｌｌｌｌｌｎｉｉ逡逑．邋~s擎逡逑图１．邋ＡＴ１Ｒ被不同配体激活后细胞内的ＩＰ１含量。逡逑＊＊，ｐ＜０．０１；ＡＴｌＲ的不同配体刺激组与对照组进行比较。ｎ．ｓ．，没有显著差异。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｂａｒ邋ｇｒａｐｈ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩＰ１邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＡＴＩＲ逡逑ｌｉｇａｎｄｓ．邋Ｔｈｅ邋ＩＰ１邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ａｎ邋Ｅｌｉｓａ邋Ｋｉｔ．邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｌｉｇａｎｄ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｔｏ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｎ．ｓ．，，邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．逡逑１．３检测不同配体引起的ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ倍号通路逡逑接下来我们通过ＢＲＥＴ实验方法

信号途径,配体,对照组

图２ａ－ｂ．检测不同配体激活ＡＴ１Ｒ后产生的ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ－ｌ或（３－ａｒｒｅｓｔｉｎ－２信号途径。逡逑＊＊，？＜00１；”＊，１３＜000５；八丁１１１的不同配体刺激组与对照组进行比较。１＾，没有逡逑显著差异。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２ａ－ｂ．邋Ｓｕｍｍａｒｙ邋ｂａｒ邋ｇｒａｐｈ邋ｏｆ邋｜３－ａｒｒｅｓｔｉｎ－ｌ邋ｏｒ邋Ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ－２邋ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ邋ｉｎｄｕｃｅｄ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R363

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