【摘要】：目的 构建百日咳杆菌腺苷酸环化酶(adenylate cyclase toxin,CyaA/ACT)及其结构域RTX(repeat-in-toxin,RTX)的表达质粒,获得纯度较高的CyaA和RTX蛋白。利用小鼠百日咳气雾感染模型来评估腺苷酸环化酶类毒素抗原RTX和新型佐剂单磷酸脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)在无细胞百日咳疫苗中(acellular pertussis vaccine,aP)中的免疫保护效果,从而更好地理解在小鼠感染模型中继续改善aP的方法。方法 本研究的第一部分从百日咳CS株基因组中以PCR方法获取了 CyaA、CyaA 的修饰基因—赖氨酸酰基转移酶(cyclolysin activating lysine acyltransferase,CyaC)和CyaA中的结构域RTX基因(CyaA的类毒素形式)并分别克隆到pET-Duet-1 和 pET-28a 表达载体上,构建 pET-Duet-l-CyaC-CyaA 和 pET-28a-RTX两个表达载体,并在BL21中进行表达。在8M尿素中,应用阴离子交换层析方法纯化CyaA蛋白,利用镍离子层析技术纯化RTX蛋白,并由测序与Western blot的方法分别验证所表达目的蛋白的正确性。研究的第二部分在aP的基础上配制了 aP+RTX、aP+MPLA、aP+RTX+MPLA以及aP+CyaA试验疫苗,并利用wP和生理盐水为对照组以人用剂量(Human Dose,HD)的1/40进行两针的免疫接种程序(0和3周),经腹腔免疫途径免疫Balb/c小鼠。检测小鼠免疫前与每次免疫后的抗体水平。在免疫完成后的一周采用气雾攻击的方式感染小鼠。在感染后的特定时间点检测各组外周血白细胞水平、肺部、支气管、肝脏和脾脏百日咳杆菌克隆数、外周血清和肺组织中的细胞因子水平以及脾脏T细胞分型。结果 第一部分中成功构建了 pET-Duet-CyaC-CyaA和pET-28a-RTX两个表达载体,并且在BL21中分别以包涵体与分泌的形式成功表达。在8M尿素中,应用阴离子交换层析方法获得了 CyaA蛋白;利用镍离子层析技术获得了 RTX蛋白,并通过测序和Western blot分别验证了所表达蛋白的正确性。第二部分中,除对照组和wP组,各无细胞疫苗组免疫完成后均诱导了较高的PT、FHA和PRN抗体水平;而无论是添加的CyaA还是RTX的疫苗组,都诱导了一定程度上的针对CyaA的抗体水平。另外MPLA和CyaA都具有一定的佐剂效应,而RTX并未发现有此效果。对照组在感染后的第6天白细胞水平开始升高,并在第14天达到高峰,而wP组在第10天白细胞有所升高,第14天便迅速恢复至正常值,而各无细胞疫苗组在感染后的第14天白细胞均有轻微的升高,第21天便恢复至正常水平。对照组肺部和支气管肺部菌落数在感染后的第2天均有明显升高,在第14天达到高峰;而各疫苗组也均有一定量的细菌定植,此外,各组支气管的定植数低于肺部,且气管的清除速度也明显快于肺部清除。细胞因子和T细胞分型分析结果表明,自然感染引起较高的Th1和Th17型细胞免疫,wP组与添加MPLA组也引起较高的Th1反应,而添加的CyaA组可明显提高Th17反应,而添加RTX组在使用的剂量免疫下反而降低了 Th17反应。结论RTX同CyaA一样可诱导产生识别CyaA的抗体,但不具有佐剂效应,且诱导的细胞免疫反应与CyaA也不尽相同,CyaA的加入显著提高了Th17反应,而RTX的加入反而降低了 Th17反应;另外,CyaA的加入对小鼠呼吸道组织百日咳杆菌的清除率有明显的提高,而RTX的单独加入对组织中细菌的清除率没有明显改善。MPLA的单独加入有极大的佐剂效应,而且有助于促进Th1的反应,但对组织中细菌的清除率没有明显改善。RTX与MPLA共同使用也有极大的佐剂效应,且有助于提高肺组织局部的Th1细胞反应,此外,对小鼠气管组织的百日咳清除有一定程度上的改善。
【图文】：
未显著改变这一发病率［７］。即使在疫苗覆盖率超过９０％以上的国家，感染率能达逡逑到每年ＭＰ，８，＇基于国家百日咳监查系统的数据，美国、欧洲以及中国的百逡逑日咳发病率都呈现出相同的发病率增加趋势（图１）。全球百日咳发病率的增加逡逑可能反映了检测方法学灵敏度的提高、疫苗诱导的保护力和保护时间的有限以及逡逑病原体的适应／进化［１（），ｕ，１２，１３］。其中一个很重要的因素可能是目前使用的ａＰ无法逡逑在基础免疫后诱导强效的细胞免疫，而强效的细胞免疫是疫苗介导长期保护的必逡逑要条件［１４］。逡逑■■邋ｕＱ逡逑ＥＷＩｉＢｔｌｉＭＩＨｌＢ逡逑９逡逑
ＣｙａＡ是重复子毒素家族（ｒｅｐｅａｔｓ邋ｉｎ邋ｔｏｘｉｎ邋ｆａｍｉｌｙ）的成员之一，，含有１７０６逡逑个氨基酸残基，由Ｎ－末端腺苷酸环化酶催化结构域（ａｄｅｎｙｌａｔｅ邋ｃｙｃｌａｓｅ邋ｄｏｍａｉｎ，逡逑ＡＣＤ）和Ｃ－末端溶血素结构域（ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ，邋Ｈｌｙ）两个功能不同的组成（图２）逡逑［６１］。ＣｙａＡ－ＡＣＤ具有依赖钙调蛋白（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，邋ＣａＭ）激活的ＡＴＰ环化酶活性，逡逑ＣｙａＡ－Ｈｌｙ具有溶血活性，这两种活性都可以独立发挥作用，即腺苷酸环化酶和逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392
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