鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株的构建及其对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响
本文关键词：鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株的构建及其对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:构建稳定的沙门氏菌表达载体,在此基础上构建鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株并研究其稳定性。体外建立鼠伤寒沙门氏菌感染Henle-407的细胞模型,观察沙门菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制。为探讨鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvC致病机制提供理论和实验依据,并为后续利用动物模型进行该基因功能的研究提供工具和手段。方法:一、鼠伤寒沙门氏菌spv基因荧光回补株的构建及其稳定性的研究。以低拷贝克隆载体pACYC-184为基础,根据GenBank数据库中公布的eGFP基因序列,上游增加Trc Promoter启动子,下游增加rrnB ribosomal终止子,两端位点上、下游序列设计相应酶切位点,采用多重PCR的方法合成pACYC184-eGFP载体,并依次调取及克隆aphA-hok-parDE基因和spv基因,构建得到pACYC184-eGFP-HOK载体、pACYC184-spvB-eGFP-HOK载体及pACYC184-spvC-eGFP-HOK载体,分别电转化入对应的鼠伤寒沙门氏菌spv基因缺陷变异株得到相应的回补株,并对质粒的稳定性及荧光蛋白表达情况进行检测。二、沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究。携带spv基因(Salmonella plasmid virulence genes)的野生型鼠伤寒沙门氏菌211、敲除spvC的缺陷变异株(ST211-△-e-spvC)及回补株(ST211-c-spvC)与Henle-407细胞共培养,取不同干预时间点的细胞进行实验。荧光显微镜观察细胞核形态学改变和胞内菌数量;Promega荧光素酶发光法检测Caspase3/7活性;Western blot法检测ERK和p-ERK表达水平;胞内集落形成单位的检测采用平板菌落计法。结果:一、鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株的构建及其稳定性的研究。1.经PCR及基因测序证实成功构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因荧光回补株。2.含有低拷贝质粒的回补株在连续培养12代或144h都未发生丢失,在细菌感染细胞模型中用荧光显微镜可观察到细菌带绿色荧光。二、沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究。1.荧光显微镜下ST211感染组与ST211-c-spvC感染组细胞在4h出现大量的细胞核呈波纹状或折缝样、部分染色质凝聚等早期细胞凋亡形态学改变,而ST211-△-e-spvC感染组及空白对照组无明显凋亡形态学改变。感染24h,ST211感染组与ST211-c-spvC感染组细胞的染色质高度凝聚边缘化、产生凋亡小体并出现大量以坏死为特征的形态学改变,ST211-△-e-spvC仅部分细胞存在凋亡、坏死形态学改变。2.Caspase-3/7活性检测结果显示,各组Caspase-3/7活性随感染时间的延长而升高,0h和4h,三个感染组间的Fluorescence值无明显差异(P0.05);感染后4h,细菌感染组较空白对照组出现显著差异(P0.01);感染的8h、12h和24h,ST211-△-e-spvC感染组较ST211-eGFP感染组和ST211-c-spvC感染组的Fluorescence值有差异(P0.05)。3.p-ERK蛋白的比值分别为(24h;空白对照组,0.89±0.03;ST211-eGFP感染组,0.12±0.02;ST211-△-e-spvC感染组,0.74±0.05;ST211-c-spvC感染组,0.11±0.04),ST211-eGFP感染组与ST211-c-spv C感染组的p-ERK蛋白的比值较ST211-△-e-spvC感染组显著降低(P0.01)。4.共培养的前4h,组间胞内活菌数无明显差异(P0.05)。在干预后8h、12h和24h,ST211-eGFP感染组与ST211-c-spvC感染组胞内活菌数高于ST211-△-e-spvC感染组(P0.05)。结论:1.高度稳定且含有绿色荧光蛋白标签的沙门氏菌表达载体及spv基因回补株构建成功,为深入研究鼠伤寒沙门菌毒力基因的功能奠定了基础。2.沙门菌质粒毒力基因spvC可通过诱导细胞凋亡促进细菌在宿主细胞内的存活和增殖,进而加重细胞损伤,这一作用可能与其影响ERK的磷酸化水平有关。
【关键词】：鼠伤寒沙门氏菌 spv hok/sok parDE 细胞凋亡 MAPK
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：
- 摘要3-5
- ABSTRACT5-11
- 第1章 前言11-14
- 第2章 鼠伤寒沙门菌spv基因荧光回补株的构建及其稳定性研究14-40
- 2.1 材料14-17
- 2.1.1 菌株、质粒14-15
- 2.1.2 主要试剂及仪器15-16
- 2.1.3 主要培养基及试剂配制16-17
- 2.2 方法17-33
- 2.2.1 技术路线17-22
- 2.2.2 eGFP基因（含启动子终止子）的合成及克隆22-26
- 2.2.3 HOK基因的调取及克隆26-28
- 2.2.4 spvB及spvC基因的调取及克隆28-32
- 2.2.5 电感受态细胞的制备及电转化入沙门氏菌32-33
- 2.2.6 质粒稳定性评价33
- 2.3 结果33-38
- 2.3.1 PCR合成eGFP基因（含启动子终止子）33-34
- 2.3.2 eGFP基因（含启动子终止子）的克隆及鉴定34-35
- 2.3.3 hok/sok-par ED（简称HOK）基因的调取35
- 2.3.4 hok/sok-par ED（简称HOK）基因的克隆35-36
- 2.3.5 spvB及spvC基因的调取36
- 2.3.6 spvB及spvC基因的克隆36-37
- 2.3.7 平板计数法测量质粒稳定性结果37-38
- 2.4 讨论38-40
- 第3章 沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究40-53
- 3.1 材料40-42
- 3.1.1 菌株40
- 3.1.2 细胞株40
- 3.1.3 主要试剂及仪器40-41
- 3.1.4 主要培养基及试剂配制41-42
- 3.2 方法42-46
- 3.2.1 细菌培养及定量42-43
- 3.2.2 细胞的分组及培养43
- 3.2.3 细胞感染模型的建立43-44
- 3.2.4 细胞爬片制备及DAPI染色44
- 3.2.5 Caspase-3/7 活性的检测44
- 3.2.6 Western blot法检测MAPK通路蛋白分子表达水平44-45
- 3.2.7 胞内菌计数45
- 3.2.8 统计学分析45-46
- 3.3 结果46-50
- 3.3.1 DAPI荧光染色观察凋亡过程中细胞核形态学改变46-47
- 3.3.2 Promega荧光素酶发光法检测Caspase3/7 活性47-48
- 3.3.3 Western blot法检测MAPK通路蛋白分子表达水平48-49
- 3.3.4 胞内菌计数结果49-50
- 3.4 讨论50-53
- 第4章 结论和展望53-54
- 4.1 结论53
- 4.2 展望53-54
- 致谢54-55
- 参考文献55-57
- 攻读学位期间的研究成果57-58
- 综述58-66
- 参考文献63-66
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