盆腔器官脱垂动物模型探索及人脐带间充质干细胞重建盆腔器官脱垂薄弱阴道壁的研究

发布时间：2020-05-08 06:19

【摘要】：研究背景盆腔器官脱垂(Pelvic organ prolapse,POP)是全球性的健康问题,可造成行走不适,或排尿、排便及性生活功能障碍,严重影响女性的生活质量。阴道及其支持结缔组织的完整性对于盆腔脏器正常解剖位置及功能的维持是至关重要的。人体阴道是由四层结构组成的纤维肌肉管腔,其中富含Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的固有层和平滑肌层是阴道的两层重要结构,为阴道壁提供抗张力。这些结构成分的变化可导致阴道壁生物力学特征的变化,进而导致POP的发生。然而,POP患者阴道壁组织结构变化的相关研究还比较少见,且仅有的一些研究结论仍不一致。因此,在本研究中,我们首先收集了病例组POP患者及对照组非POP的阴道壁组织,通过比较分析,进一步揭示POP患者阴道壁组织结构及细胞成分的变化情况。其次,POP的病理生理学机制目前仍不清楚。探索合适的动物模型不仅有利于提高我们对POP病因学及疾病自然进展的认识,而且对于研发POP的新型治疗手段同样具有重要意义。阴道分娩、绝经、年老是POP发生的主要高危因素。因此,本研究构建了 SD大鼠手术绝经模型,首次全面分析了短期及长期绝经后大鼠阴道前壁组织形态学、生化及生物力特征的变化,来判断该模型是否为研究POP新型疗法的适宜动物模型。此外,非人灵长类动物一直被认为是研究POP的最佳动物模型,但相关研究的基础资料仍十分薄弱,我们又进一步对年老经产雌性恒河猴自发POP的患病率进行调查,为日后以恒河猴作为POP研究的理想动物模型提供更多的信息支撑。第三,组织工程技术的发展为重建受损组织或器官提供了更多的选择。近年来,不同来源的间充质干细胞在压力性尿失禁的临床前动物实验及临床研究中己得到广泛使用。遗憾的是,使用干细胞来治疗POP的研究目前仍非常少见。本研究基于我们构建的手术绝经SD大鼠模型,将人脐带间充质干细胞(Human Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells,HUMSCs)注射至大鼠阴道前壁,观察其在阴道壁胶原蛋白及平滑肌组织的修复及再生过程中的作用,以探究HUMSCs是否有助于绝经后大鼠的阴道壁恢复至正常结构,为POP组织工程技术的研发提供理论基础。研究方法1.标本收集及组织形态学分析:选择2018年6月到2018年12月在北京协和医院妇产科接受阴式子宫切除+盆底重建手术的重度阴道前壁膨出(Ⅲ/Ⅳ度)患者为病例组,同期因非POP的妇科良性疾病行子宫切除手术的患者为对照组。病例组所取标本为患者阴道前壁膨出最重部位的阴道全层;对照组取穹窿处阴道前壁全层组织。通过组织切片染色,免疫组化及免疫荧光染色方法检测阴道前壁Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、平滑肌含量及成纤维细胞的变化。2.动物模型构建:首先通过切除SD大鼠双侧卵巢制作绝经模型,使用组织学染色、免疫组化、Western blot、单轴生物力检测等方法了解绝经后2周、4周及16周大鼠阴道前壁Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、平滑肌及相应生物力的改变;此外进一步对34只年老经产恒河猴进行POP-Q分度检查,了解恒河猴自发性POP的患病率。3.组织工程技术修复:使用手术绝经SD大鼠模型,分为4组:生理盐水组、胶原蛋白组、生理盐水+HUMSCs组、胶原蛋白+HUMSCs组。分别将生理盐水、2mg/ml胶原蛋白溶液、3×106MSCs生理盐水悬液或3×l06MSCs胶原蛋白悬液各0.3ml注射至大鼠阴道前壁,并在注射后2周、4周及12周取材。通过小动物活体成像、组织形态学分析、定量PCR、单轴生物力检测等方法探究人脐带间充质干细胞细胞在体内的存活时间、转化发生情况及对绝经后大鼠阴道前壁组织结构及生物力的修复作用。研究结果1.POP患者阴道前壁组织形态学变化:病例组胶原蛋白排列疏松,紊乱;而对照组排列密集,有序。病例组Ⅰ型胶原蛋白含量显著低于对照组(16.65±6.63%vs25.27±5.54%,P0.001)。两组间的Ⅲ型胶原蛋白含量及Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白含量比值无显著性差异。相较于对组照,病例组的肌层平滑肌束变细,排列紊乱,且肌层平滑肌含量显著下降(26.04±4.36%vs44.74±5.65%,P0.001)。对照组阴道壁固有层成纤维细胞呈长的纺锤体型,而病例组转变为圆形。病例组每高倍视野下阴道壁固有层成纤维数量较对照组显著减少(37.0±11.7vs47.5±8.3,P0.001)。2.SD大鼠手术绝经模型构建及恒河猴自发POP患病率研究:自手术绝经第2周起,大鼠的阴道前壁发生了持续的变化。较之于对照组,处理组上皮萎缩,Ⅰ型胶原蛋白逐渐增多,变化具有显著性(P0.001),Ⅲ型胶原蛋白呈下降趋势,肌层平滑肌含量逐渐下降,以16周后变化最为显著(P0.001)。单轴生物力检测显示手术绝经后16周,阴道前壁线性区域弹性模量较对照组显著增加(0.74±0.27 MPa versus 0.25±0.11 MPa,P=0.016)。动物查体中,年老经产恒河猴中自发性POP的患病率为11.8%。3.HUMSCs对SD大鼠绝经后阴道壁的修复作用:小动物活体成像显示MSCs细胞信号在一周内消失。注射后2周,胶原蛋白+HUMSCs组仍可见少量DIR标记的MSCs散在分布于阴道壁的固有层及肌层。注射至阴道壁的MSCs未发生转化。注射后4周及12周,注射MSCs的两组较未注射细胞组,Ⅰ型胶原蛋白均显著减少,Ⅲ型胶原蛋白均显著增多,Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比值均明显下降,P值均0.001。注射后12周,注射MSCs的两组肌层平滑肌含量均显著高于未注射细胞组(P0.001)。注射后2周和4周,胶原蛋白+HUMSCs组的ACTA2基因表达水平均显著高于生理盐水组(P=0.042及P=0.040)。在不同时间点,注射MSCs组促血管生成的生长因子(bFGF或VEGF)的基因表达水平均显著高于未注射细胞组。12周时,胶原蛋白+HUMSCs组的线性区域刚度显著低于生理盐水组(0.71±0.40 N/mm vs 2.32±0.97 N/mm,P=0.025)。研究结论1.POP患者阴道前壁胶原蛋白排列疏松、紊乱,Ⅰ型胶原蛋白含量显著降低;肌层平滑肌束变细,排列紊乱,且平滑肌含量显著下降;固有层成纤维细胞形态发生改变,且数量明显减少。2.大鼠阴道壁的组织结构与人类相似,手术绝经2周后大鼠阴道壁的Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白及平滑肌可发生持续的改变,手术绝经大鼠可作为POP新型治疗手段研究的动物模型,但与人体不同的是,正常SD大鼠阴道前壁固有层以Ⅲ型胶原蛋白为主,并非最理想的动物模型。3.非人类灵长动物恒河猴体态、生殖生理及妊娠分娩过程与人类最为相似,年老经产的恒河猴中自发性POP的患病率为11.8%,为POP研究的更合适的动物模型。4.HUMSCs注射至大鼠阴道前壁后,可将绝经大鼠的阴道前壁的组织成分及生物力恢复至正常,干细胞有望成为治疗POP这种退行性疾病的新型治疗手段;HUMSCs在体内发挥组织修复功能主要是通过分泌作用而非转化作用。
【图文】：

固有层,双折射,病例,对照组

三．天狼猩红染色显示病例组及对照组Ｉ／ＩＩＩ型胶原蛋白在固有层的含量及比例的变化逡逑在偏振光镜头下，可以观察到固有层胶原蛋白束呈混合性的双折射染色，从绿色到逡逑黄色、橙色及红色（图１）。绿色胶原蛋白束为较细的ＩＩＩ型胶原蛋白，而橙黄及红色胶逡逑原蛋白束为较粗的成熟胶原蛋白，即Ｉ型胶原蛋白如图１所示，病例组Ｉ型胶原蛋逡逑白含量为１６．６５±６．６３％，对照组Ｉ型胶原蛋白含量为２５．２７±５．５４％。两组间的Ｉ型胶原蛋逡逑白含量具有显著性差异，ＰＯＰ组Ｉ型胶原蛋白含量显著低于非ＰＯＰ组，ＰＣ０．００１。非逡逑ＰＯＰ组Ｉ型胶原蛋白排列更加密集、有序，而ＰＯＰ组Ｉ型胶原蛋白排列疏松、紊乱。病逡逑例组ＩＩＩ型胶原蛋白含量为１３．２９±７．７９％，对照组ＩＩＩ型胶原蛋白含量为１２．９５±７．８７％。两逡逑组间的ＩＩＩ型胶原蛋白含量无显著性差异，，Ｐ＝０．８０２。病例组Ｉ／ＩＩＩ型胶原蛋白含量比值为逡逑２．３３±３．８８，对照组Ｉ／ＩＩＩ型胶原蛋白含量比值为３．２８±３．２１。两组间的Ｉ／ＩＩＩ型胶原蛋白含逡逑量比值无显著性差异

免疫组织化学,情况,平滑肌,病例

四．ａ－ＳＭＡ免疫组织化学染色法检测病例组及对照组肌层的非血管平滑肌含量逡逑我们使用ｃｘ－ＳＭＡ免疫组织化学染色来检测病例组及对照组阴道前壁肌层非血管平逡逑滑肌的形态及含量变化（图２）。图２Ａ显示阴道壁的组织结构，由上皮（ｅｐｉ）、固有层逡逑（ｌｐ）、肌层（ｓｍ）及外膜（ａｄ）构成。较之于对组照（图２Ｃ），病例组（图２Ｂ）的肌逡逑层平滑肌束变细，排列紊乱。分析结果显示，病例组肌层非血管平滑肌含量为逡逑２６．０４±４．３６％，对照组的肌层非血管平滑肌含量为４４．７４±５．６５％，病例组的肌层平滑肌含逡逑量显著低于对照组，户＜０．００１。逡逑Ａ逡逑ｅｐｉ逡逑ｙ逡逑ａｄ邋一抑？逡逑Ｂ逦？一－逦：Ｓｒ：：一；邋：邋＾逡逑ｂ１逡逑□邋榦逡逑ｃ邋、逦．＇ｉ＿邋震逡逑逢邋＇逡逑Ｄ邋ｉ６０］—：—逡逑卜ｎ邋■逡逑１Ｊ－Ｕ＿樐￣逡逑图２．ＣＸ－ＳＭＡ免疫组织化学阴道前壁染色情况。Ａ为阴道壁组织结构的示意图（ｘ２０），邋ｅｐｉ：上皮，ｌｐ：逡逑固有层，ｓｍ：肌层，ａｄ：外膜；Ｂ图为病例组（＞＜５０），右侧ｂｌ显示为局部放大图像（ｘ２００）；邋Ｃ图为逡逑对照组（Ｘ５０），右侧ｃｌ显示为局部放大图像（ｘ２００）；邋Ｄ图为两组肌层非血管平滑肌含量对比的柱状逡逑图
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.2;R-332

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