mTORC1和mTORC2在人肝细胞氨基酸代谢关键酶表达中的调控作用

发布时间：2020-05-08 14:19

【摘要】：肝脏是人体重要的物质代谢器官。肝细胞中的物质代谢是一个复杂的过程,受到各种内外因素的调控,其中信号转导通路发挥重要作用。肝脏天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)和α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)等氨基酸代谢关键酶的含量反映肝脏的健康状态,但这些酶的表达调控机制并不十分清楚。mTORC1和mTORC2是细胞生长、代谢的中心协调器,目前对二者在肝细胞氨基酸代谢关键酶基因表达调控中的作用了解还很少。本研究首先以人正常肝细胞(HL-7702)和肝肿瘤细胞(HepG2)为模型,比较两种细胞中氨基酸代谢所涉及6种关键酶的表达差异;随之以HL-7702细胞为模型,研究mTORC1和mTORC2在氨基酸代谢关键酶基因表达调控中的作用与机制;最后通过比较分析,确定mTORC1和mTORC2在调控氨基酸代谢关键酶基因表达中的不同作用。实验利用RT-qPCR检测目的基因的mRNA水平,ELISA检测酶含量,Western blot检测mTORC1、mTORC2和转录因子NF-κB、STAT3活性变化。结果表明:(1)人正常肝细胞HL-7702细胞内AST、OGDH、GDH的含量显著高于肝癌细胞HepG2(p0.01),而GAD、ODC、GST显著低于HepG2(p0.01);HL-7702细胞培养液中AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST含量低于HepG2细胞培养液中的含量;(2)Rapamycin处理HL-7702细胞,显著抑制mTORC1信号通路相关蛋白mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因的mRNA水平显著减低(p0.01),细胞内和培养液中酶含量显著下降(p0.01);(3)HL-7702细胞转录后沉默Raptor基因,和对照组相比,mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平明显降低,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平显著降低(p0.01),细胞内酶含量显著减少(p0.01);(4)HL-7702细胞过表达Rheb基因,和对照组相比,mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平升高,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平显著升高(p0.01),细胞内酶含量明显升高(p0.01);(5)谷氨酸信号激活HL-7702细胞mTORC1信号通路,转录因子NF-κB活性增强,但对转录因子STAT3活性无影响;外源谷氨酸提高细胞AST基因mRNA水平(p0.01)和酶含量(p0.01);(6)鸟氨酸信号激活HL-7702细胞mTORC1信号通路,增强转录因子NF-κB活性,对STAT3活性无影响,细胞ODC基因转录增强(p0.05),酶含量增加(p0.05);(7)HL-7702细胞转录后沉默Rictor基因,mTORC2信号通路相关蛋白mTOR和AKT的磷酸化水平下降,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平显著降低(p0.01),细胞内酶含量显著下降(p0.01);(8)HL-7702细胞过表达mTORC2关键组分mSIN1编码基因mSIN1,mTOR和AKT的磷酸化水平升高,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平显著升高(p0.01),细胞内酶含量明显升高(p0.01);(9)对比mTORC1和mTORC2对HL-7702细胞氨基酸代谢6种关键酶基因表达的影响,mTORC1的调控作用强于mTORC2。综上所述,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST等氨基酸代谢关键酶含量在人正常肝细胞HL-7702与肝肿瘤细胞HepG2中的合成与分泌存在差别,HepG2分泌6种酶的能力强于HL-7702,为以后利用这些酶含量变化预测肝细胞恶性转化提供了基础数据。HL-7702细胞中,mTORC1调节氨基酸代谢相关关键酶基因AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST表达和酶分泌;mTORC1介导谷氨酸或鸟氨酸信号,通过调节转录因子NF-κB活性调节AST或ODC表达。mTORC2也参与上述6个基因的表达,其调控作用相对弱于mTORC1。研究结果展示了肝细胞中氨基酸代谢关键酶基因的表达调控模型,对进一步了解肝脏中氨基酸的代谢机制,为临床靶向治疗肝脏疾病提供一定的科学依据。
【图文】：

他蛋白相结合，形成两种不同蛋白复合物 mTORC1TOR Complex 2），，两种蛋白质复合物调节不同的细胞图 1.1 mTOR 的蛋白结构Fig. 1.1 The protein structure of mTOR

mTORC1的组成
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

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本文编号：2654780