【摘要】：鸭乙型肝炎病毒与人乙肝病毒同属嗜肝DNA病毒科,它们在病毒的结构、病毒的复制过程、感染宿主机制和致病机制等方面比较类似,因而以鸭乙型肝炎病毒为动物感染模型对研究嗜肝病毒的复制周期并抑制病毒复制大有助益,DHBV体外感染原代鸭肝细胞模型和体内感染动物模型还可用来研究病毒基因的作用以及筛选治疗药物。本研究通过建立一种新型的环介导等温扩增检测系统,利用其特异性强、灵敏度高、快速简便的特点,优化构建出一套即能简化操作流程,又能满足快速检测需要的适用于基层单位及实地现场检测的检测系统。并通过不断地优化LAMP体系各组分配比和反应条件,建立一个最佳的能够特异检测鸭乙型肝炎病毒的LAMP反应体系,使鸭乙型肝炎病毒可以在基层环境大规模大批量被检测出来。经过大量的实验,得到了鸭乙型肝炎LAMP检测系统的最优化条件为:1.酚红和甲酚红混合染色液作为显色试剂,阳性结果显示为亮黄色,阴性结果显示为紫红色。颜色差别大,利于观察判定结果;2.通过设置梯度实验选择最佳Mg离子浓度,发现体系中Mg离子浓度为6mM时,扩增效果最好;3.通过调节dNTPs浓度发现,当dNTPs浓度为1.2 mM时,扩增效果最好;4.对LAMP体系进行时间梯度实验时,可观察到反应时间为50 min的电泳图条带最为明亮,扩增效果最好,因此选择反应50 min为最佳反应时间;5.进行LAMP温度梯度实验时,发现反应温度为63℃、64℃、65℃时,电泳胶图泳带都较为明亮,扩增效果较好,最后选择Bst DNA聚合酶的最佳酶活温度65℃作为反应的最优温度。利用优化好的LAPM检测系统批量检测河南南阳、安徽亳州、湖北潜江三地鸭场采集的鸭血清样本,筛选出携带DHBV病毒的阳性样本。结果显示,河南南阳、安徽亳州、湖北潜江三地的鸭乙型肝炎感染率分别为17.6%、13.6%、16.1%,差异统计学不显著(P0.05)。从三地的DHBV阳性样本中各挑选1份进行DHBV全基因的克隆、测序和序列分析,河南南阳、安徽亳州、湖北潜江3株DHBV分离株基因组全长分别为3024、3027、3024 bp。序列分析数据显示3株DHBV间核苷酸同源性为95.1%~97.4%,与选取的25株参考株同源性为90.3%~96.2%。遗传进化树和P蛋白氨基酸关键位点分析证明,河南南阳、安徽亳州2株分离株为类中方基因型,湖北潜江分离株不属于中方型和西方型两大分支,属于独立小分支,可能产生了病毒重组。
【图文】：
鸭乙型肝炎基因结构
DHBVS保守区域扩增Figure.2-1AmplificationresultsofconservedregionofDHBVSgene
【学位授予单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65;R373
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