Erythropoietin信号通路对成体大鼠脊髓内源性神经干细胞增殖分化作用的实验研究

发布时间：2020-05-11 12:11

【摘要】：促红细胞生成素(Erythropoietin;Epo)是一种主要由成人肾脏和胎儿肝脏分泌的造血生长因子,属于Ⅰ型细胞因子超家族成员,既往因其在刺激造血干细胞的增殖与分化中的关键作用而在临床广泛应用于治疗各种原因引发的贫血。促红细胞生成素受体(Erythropoietin receptor;Epo R)是Epo的特异性受体,属于单跨膜I型细胞因子受体,Epo通过与Epo R结合而激活下游的信号通路产生各种生物学作用。近些年来,关于Epo信号通路的非刺激造血的作用不断被报道,特别是在各种类型的中枢神经系统损伤中表现出的组织保护作用受到广泛的关注。Epo与Epo R在中枢神经系统的胶质细胞、神经元及内皮细胞中均有广泛的表达,实验研究证明Epo在包括中风、多发性硬化、自身免疫性脑髓炎、精神分裂症、脑损伤及脊髓损伤(spinal cord injury;SCI)等多种中枢神经系统疾病中具有明显的神经保护和促进神经再生的作用。SCI是一种临床工作中常见的严重致残性疾病,给家庭和社会带来了巨大的痛苦和损失,目前尚且没有有效的治疗手段。SCI的病理过程主要由原始的物理损伤和继发的化学损伤组成,由于原始损伤的不可预估性,目前的治疗研究主要集中于控制各种急性缺血坏死及各种炎性反应所带来的继发损伤。研究发现Epo可以明显的促进SCI后的神经功能恢复,其作用可能通过抗炎、抗凋亡及促进血管再生等多种机制来完成,而且目前已经有Epo在临床实验性应用的初步报道,这使得Epo成为非常有临床应用潜力的治疗SCI的药物之一。Epo信号通路促进脑损伤神经功能恢复的一个重要机制是促进脑内源性神经干细胞(Neural stem cells;NSCs)向神经元分化,而这同样也是解决应用NSCs修复SCI的关键问题。成体脊髓属于非神经生发区“non-neurogenic area”,正常情况下没有新生神经元产生,即使在SCI后内源性NSCs大量增殖,但因为脊髓内环境的严重破坏,最终也基本上全部分化成为星型胶质细胞最终形成疤痕实际阻碍了神经再通。由于干细胞分化与其所处的微环境直接相关,Epo信号通路的神经保护作用为改善SCI后的内环境提供了可能,这就给脊髓内源性NSCs的神经生发提供了机会,Epo促进SCI后功能恢复已经被广泛证实,多种作用机制已经被发现,但其对脊髓内源性NSCs增殖分化的作用及其能否作为其作用机制的一部分目前尚且没有文献报道。本课题设计通过三部分研究探讨Epo信号通路对大鼠脊髓内源性NSCs增殖分化的影响。实验第一部分是Epo对SCI大鼠内源性NSCs增殖分化影响的在体研究。取成年SPF级SD大鼠,改良Allen法制备大鼠SCI模型,实验组腹腔注射Epo(5000U/kg)×7天,对照组腹腔注射等量生理盐水×7天。术后分别于2天、8天及14天取材,对内源性NSCs、神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞行免疫荧光染色,同时对Epo及Epo R的表达行Western blot检测。结果显示实验组神经元(P0.01)及少突胶质细胞分化(P0.05)比例明显增高,星型胶质细胞(P0.05)分化比例明显减少,内源性NSCs数量两组之间无显著性差别。Epo注射增加了SCI后Epo和Epo R的表达,但在2天和8天与对照组之间没有显著性差异,在14天实验组则明显强于对照组(P0.01),说明Epo腹腔注射能够明显的延长SCI后的Epo信号通路的作用时间,促进神经元及少突胶质细胞分化,减少星型胶质细胞的分化,但对于内源性NSCs增殖没有影响。实验第二部分是Epo对正常大鼠内源性NSCs增殖分化影响的在体研究。取成年SPF级SD大鼠,实验组腹腔注射Epo(5000U/kg)×7天,对照组腹腔注射等量生理盐水×7天,术后分别于2天、8天及14天取材,对内源性NSCs、神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞行免疫荧光染色,同时对Epo及Epo R的表达行Western blot检测。结果显示Epo腹腔注射在2天和8天可以明显提高Epo的表达(P0.01),但到14天Epo的表达与对照组已经没有差别。Epo R的表达在三个时间点均明显高于对照组(P0.01)。对于内源性NSCs的数量及分化没有影响。实验第三部分是Epo对大鼠内源性NSCs增殖分化影响的体外研究。证实Epo信号通路对内源性NSCs的直接作用结果。获取SCI后脊髓内源性NSCs行体外培养,分Epo组(10U/ml)、空白组及Epo+抑制剂组,体外培养7天后,对内源性NSCs进行神经球计数、测量平均直径及流式细胞检测,进行神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞行免疫荧光染色,同时对Epo及Epo R的表达行Western blot检测。结果提示Epo及Epo R的表达明显增加,实验组神经元(P0.01)及少突胶质细胞分化(P0.05)比例明显增高,星型胶质细胞(P0.05)分化比例明显减少,抑制剂组可以消除Epo的作用效果,内源性NSCs数量两组之间无显著性差别。综上所述,SCI后及体外实验均证明外源性Epo能够延长或者增强Epo信号通路的作用,进而促进大鼠内源性NSCs向神经元及少突胶质细胞分化,减少星形胶质细胞分化,但对增殖没有影响。对于正常大鼠,外源性Epo虽然可以激活信号通路,但对于内源性NSCs的增殖分化均没有影响。
【图文】：

图 1: Epo 信号通路促进 SCI 大鼠脊髓内源性 NSCs 的神经元分化。免疫荧光染色显示在 SCI后 2 天、8 天及 14 天，SCI+Epo 组的神经元分化均明显优于 SCI+Saline 组，数据统计显示P<0.01。β-tubulin 呈绿色，BrdU 呈红色，，DAPI 呈蓝色。比例尺：25 μm。Figure 1. Epo signaling promote neuronal differentiation of endogenous NSC in spinal cord afterSCI. Fluorescence immunostaining images (merged) showing the co-localization of β-tubulin (green)with BrdU (red) at 2, 8, and 14 days in the Epo- and Saline-treated groups after SCI. DAPI (blue) wasused as a nuclear counterstain. Quantitative analysis showed an increased density of β-tubulin+/BrdU+cells at all three time points (P<0.01) in the SCI+Epo vs SCI+Saline groups. Scale bars: 25 μm.SCI+Epo 组的新生少突胶质细胞分化在 2 天时与 SCI+Saline 组无明显差别（12.8(10.2,13.0)% vs 11.7(10.6,12.4)%；p>0.05），但在第 8 天（14.6(13.9,17.6)% vs

图 2：Epo 信号通路促进 SCI 大鼠脊髓内源性 NSCs 的少突胶质细胞分化。免疫荧光染色显示在 SCI 后第 2 天两组少突胶质细胞分化无明显差别(P>0.05)，但在 SCI 后的第 8 天及 14 天，SCI+Epo 组的少突胶质细胞分化均明显优于 SCI+Saline 组(P<0.05)。O4 呈绿色，BrdU 呈红色，DAPI 呈蓝色。比例尺：25 μm。Figure 2. Epo signaling promote oligodendrocytic differentiaiton of endogenous NSC in spinalcord after SCI.Fluorescence immunostaining images (merged) showing the co-localization of O4(green) with BrdU (red) at 2,8 and 14 days in the Epo- and Saline-treated groups after SCI. DAPI(blue) was used as a nuclear counterstain. Quantitative analysis showed an increased density ofO4+/BrdU+cells at day 8 and day 14 time points (P<0.05) in the SCI+Epo vs SCI+Saline groups, andno difference between two groups at day 2(P>0.05).Scale bars: 25 μm.SCI+Epo 组的星型胶质细胞分化比例上在三个时间点上均明显少于 SCI+Saline
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

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本文编号：2658433