弓形虫慢性感染小鼠脑内长链非编码RNA（lncRNA）的差异表达及作用机制的研究
发布时间：2020-05-11 11:27
【摘要】：弓形虫是细胞内寄生原虫,呈世界性分布,广泛寄生于人和动物的有核细胞内。能够感染所有温血动物,包括人,引起人畜共患弓形虫病。血清学调查结果表明,全世界约有3 0%的人感染弓形虫。免疫功能正常的宿主感染弓形虫后,一般表现出没有明显症状的感染情况。现在的研究表明,弓形虫的这种隐性感染模式虽然没有明显的症状,但是能够侵入宿主的神经系统,影响神经细胞的功能,从而导致宿主脑损害,甚至精神疾病的发生。现在,越来越多的证据表明弓形虫慢性感染能影响神经细胞损伤并参与神经系统疾病。新近研究发现,Non-coding RNA(ncRNA)是基因组中一类重要的非编码RNA,不具有蛋白编码功能,但是在生命过程中却发挥着重要的调控功能。其中长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)的长度大于200个核苦酸,作为神经系统一类重要的非编码RNA,通过与靶基因mRNA结合,调控基因转录后表达,在许多神经相关性疾病中起着重要的调节作用。在本研究中,我们用PRU株弓形虫包囊经口感染小鼠,建立弓形虫慢性感染小鼠模型,通过微阵列芯片检测lncRNA与mRNA在正常组与感染组的表达水平。通过热图、散点图分析差异表达的lncRNA和mRNA,通过cis/trans预测靶基因对差异的lncRNA进行靶基因的预测并进行GO、KEGG富集分析,将相应的基因根据功能的不同归类,将有差异的pathway进行富集,从而将相应的基因进行注释及分类,找到实验条件下显著性差异变化的生物学调控通路并确定研究的lncRNA及相应靶基因。通过生物信息学方法对lncRNA进行定位分析并确定核质位置。通过实时定量PCR扩大样本验证lncRNA及靶基因的表达。免疫组化、免疫荧光检测感染弓形虫慢性感染脑组织中蛋白的变化。利用CCK-8、流式细胞术、克隆形成、TUNEL等实验在细胞水平上研究lncRNA的功能。通过构建shRNA和过表达体系,研究lncRNA的表达变化对靶基因表达的影响,并通过Western blot检测蛋白变化。此外,我们通过RNA Pull down实验将与lncRNA相关的蛋白拉下来,并通过质谱分析,鉴定蛋白的种类,进一步揭示lncRNA调控下游靶基因的机制。芯片数据显示,感染弓形虫的小鼠脑组织中lncRNA和mRNA的表达发生了较大的变化,通过筛选发现lncRNA11496在弓形虫慢性感染脑组织中的表达差异变化较大。通过GO、KEGG富集分析,对lncRNA的靶基因和mRNA进行基因注释及分类,发现lncRNA11496和宿主精神行为的改变密切相关;通过cis/trans预测了 lncRNA11496的基因,确定lncRNA11496靶基因是Mef2c。我们证实lncRNA11496定位于细胞核内。同时,我们通过qPCR验证发现,lncRNA11496和Mef2c都是下调的。我们通过荧光定量PCR检测了干扰及过表达lncRNA11496以后,检测相应靶基因Mef2c的表达变化,结果显示,lncRNA11496正向调控Mef2c的表达。同时,我们通过Western blot检测了蛋白水平上的表达,进一步验证了这一结果。在体外培养的神经细胞中,我们转染shRNA干扰lncRNA11496及过表达lncRNA11496,通过CCK-8和克隆形成实验发现,干扰了 lncRNA11496以后,细胞增殖变得缓慢,而过表达lncRNA1 1496以后,发现细胞增殖变快。我们进一步通过流式细胞术检测了细胞周期的变化,发现lncRNA的变化影响了细胞G1、G2和S期的占比,进而影响了细胞的增殖情况。此外,我们还发现,干扰lncRNA1 1496的表达能够促进细胞凋亡,而lncRNA11496表达增加能够抑制细胞凋亡。通过RNA pull down及质谱分析,我们发现lncRNA1 1496是通过结合HDAC2来影响Mef2c的表达,进而调控神经细胞的增殖分化和凋亡。综上所述,本研究通过微阵列芯片技术检测了感染Ⅱ型弓形虫后,小鼠脑内lncRNA和mRNA的差异表达。发现lncRNA11496差异表达显著并与精神行为密切相关,并且证明lncRNA11496是通过结合HDAC2来调控其靶基因Mef2c的表达,进而影响小胶质细胞的增殖、周期及凋亡。进一步阐明了lncRNA在弓形虫慢性感染小鼠脑中的作用和调控机制,对弓形虫对宿主神经系统侵害的防治会开辟一个崭新的方向。
【图文】：
我们通过对差异表达的ＩｎｃＲＮＡ和ｍＲＮＡ进行热图分析，可以直观显示在逡逑慢性感染弓形虫和正常小鼠脑组织中不同基因的表达水平。发现共有１５００个逡逑ＩｎｃＲＮＡ的表达发生差异，其中６６２个上调，８３８个下调（图１Ａ），有８６４个ｍＲＮＡ逡逑发生变化，３５６个上调，５０８个下调（图１Ｂ）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑－１．５逦０逦１．５逦－１．５逦０逦１．５逡逑■邋■逡逑ＥＸ１邋ＥＸ２邋ＥＸ３邋ＣＴ１邋ＣＴ２邋ＣＴ３逦ＥＸ１邋ＥＸ２邋ＥＸ３邋ＣＴ１邋ＣＴ２邋ＣＴ３逡逑图１．热图分析感染组和未感染组小鼠脑组织中ＩｎｃＲＮＡ和ｍＲＮＡ的差异表达逡逑Ａ．邋ＩｎｃＲＮＡ的表达水平；Ｂ．邋ｍＲＮＡ的表达水平。逡逑Ｆｉｇｌ．邋Ｈｅａｔ邋ｍａｐｓ邋ａｎａｌｙｚｅ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＩｎｃＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｂｒａｉｎ邋ｏｆ逡逑ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｍｉｃｅ逡逑Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ＩｎｃＲＮＡ；邋Ｂ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍＲＮＡ．逡逑１７逡逑
一个而威尔直角坐标系中。散点图中Ｘ轴，Ｙ轴分别表示该点在对照及实验样品逡逑芯片中处理的信号值。通过散点图，进一步分析了邋ＩｎｃＲＮＡ及ｍＲＮＡ在弓形虫慢逡逑性感染小鼠脑组织中的差异变化（图２Ａ，２Ｂ）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑１５逦１５逡逑？邋／逡逑ｉｏ逦，？？逦？？，逦１0逡逑P牛箦义希靛危保板危保靛危靛危保板危保靛义贤迹玻⒌阃挤治霾煌虻谋泶锼藉义希粒澹桑睿悖遥危恋谋泶锼剑唬拢澹恚遥危恋谋泶锼健ｅ义希疲椋纾玻澹铃澹螅悖幔簦簦澹蝈澹穑欤铮翦澹幔睿幔欤澹箦澹簦瑁邋澹澹穑颍澹螅螅椋铮铄澹欤澹觯澹欤箦澹铮驽澹洌椋妫妫澹颍澹睿翦澹纾澹睿澹箦义希粒澹裕瑁邋澹澹穑颍澹螅螅椋铮铄澹欤澹觯澹戾澹铮驽澹桑睿悖遥危粒诲澹拢澹裕瑁邋澹澹穑颍澹螅螅椋铮铄澹欤澹觯澹戾澹铮驽澹恚遥危粒义希常危牵稀ⅲ耍牛牵歉患治霾钜毂泶锏幕蝈义衔私徊椒治霾钜毂泶锏模桑睿悖遥危涟谢蚝停恚遥危粒ü牵稀ⅲ耍牛牵歉患义戏治霾钜毂浠幕颍凑展δ艿牟煌泄槔啵钜煜灾模穑幔簦瑁鳎幔啃懈诲义霞曰蚪凶⑹秃头掷啵佣业教囟ㄊ笛樘跫虏钜毂浠模穑幔簦瑁鳎幔＝徨义瞎允静钜毂泶锏模桑睿悖遥危涟谢虼蟛糠指患谏窬钚耘涮迨芴遄饔茫喟桶峰义贤淮ァ⒐劝彼嵬淮ァ⑸窬赴脑鲋撤只暗蛲龅刃藕磐罚ㄍ迹常粒澹常拢ｅ义喜钜毂泶锏模恚遥危链蟛糠指患诘唬骰蜃樱郑牛牵菩藕磐罚评脲义献有藕磐
本文编号：2658383
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