Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗研究

发布时间：2017-03-24 19:11

  本文关键词：Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后由于中枢神经系统难以恢复而造成部分或大部分器官功能的缺失,以致出现四肢瘫痪甚至各种器官功能丧失。因此这类疾病的治疗需要高昂的治疗和护理费用,给家庭和社会带来巨大的经济和精神压力。成熟的中枢神经系统经损伤后,中枢神经纤维难以再生且难以进行自我修复,但是外周神经系统的神经纤维损伤之后却能够自我修复并恢复其相应的运动功能,主要因为两种神经系统神经纤维所存在的微环境不同。中枢神经微环境中存在多种髓磷脂相关抑制因子(Myelin associated inhibitors,MAIs),在脊髓损伤早期他们会抑制轴突的再生和后期则促进胶质瘢痕的形成。因此通过改善中枢微环境以达到干预抑制信号传递,促进神经轴突再生,可能是针对脊髓损伤行之有效的治疗方法之一。作为一种重要的MAIs,Nogo蛋白主要通过Nogo-66、Amino-Nogo两个功能域参与下游多种受体介导的轴突再生抑制效应,因此以这两个区域为靶点,阻断抑制信号传递,可能会有效促进神经突的再生和保护神经元生长锥的完整;核酸疫苗作为一种新的免疫治疗策略近年来已被广泛应用于各种疾病的治疗研究,这种技术主要由于成本低,应用前景广等多种优点而受到广泛关注;人粒细胞-巨噬细胞集落因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GMCSF)具有增强免疫应答和促进T细胞增殖的能力,是一种重要的佐剂因子。GMCSF还具有神经保护作用,可激活神经干、祖细胞且抑制胶质瘢痕的形成。本实验采用基因工程方法分别克隆Nogo-66、Amino-Nogo和GM-CSF基因片段,构建Nogo-GMCSF复合核酸疫苗。体内观察该免疫治疗策略是否能够有效地产生Nogo蛋白,进而利用机体免疫系统产生Nogo抗体,抑制髓磷脂相关抑制信号的传递。利用行为学、组织学等方法体外观察Nogo-GMCSF核酸疫苗是否有助于中枢轴突再生和动物运动功能的恢复,为脊髓损伤的免疫治疗研究提供实践基础。主要技术路线:1.载体的构建、鉴定及表达检测将PCR扩增的GMCSF、Amino-Nogo及Nogo-66三个目的片段,分别亚克隆至pc DNA3.1(+)质粒中,构建重组真核表达载体pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66,并进行PCR、酶切及基因测序鉴定。脂质体法将构建的重组质粒转染至中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞后采用免疫荧光和Western-blot法检测其在哺乳动物细胞中的表达。2.Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的制备将重组质粒pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66转化于E.coli DH5α后,大量扩增并收集无内毒素的高浓度质粒;以脂质体包裹重组质粒,按不同体积比(2:1、1:1、1:2)混匀得到Nogo-GMCSF复合核酸疫苗制剂。用远交群(Sprague Dawley,SD)大鼠为实验对象,肌肉注射免疫制备的核酸疫苗,每周免疫一次,持续免疫6w,每周跟踪检测各组核酸疫苗所产生的抗体滴度,以获得最佳免疫制剂。3.Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的免疫学及脊髓损伤治疗效果评价用最佳免疫制剂免疫大鼠,每周一次,持续免疫6w,在此期间观察动物的体重、毛发等指标评价该疫苗是否会引起自身免疫反应而导致变态脑脊髓炎的发生,并且每免疫一次之后一周检测动物血清的抗体效价。6w免疫完毕之后1周,制备脊髓左侧半横切损伤模型,对各组损伤脊髓的恢复情况进行行为学、组织学、分子水平等方面的评价,观察Nogo-GMCSF复合核酸疫苗对脊髓损伤的治疗修复效果以及轴突再生情况。4.外源基因整合情况检测Nogo-GMCSF复合核酸疫苗免疫6w之后,每周对免疫的动物取材,分别提取心、肝、脾、肺、肾、脑、脊髓以及注射部位肌肉组织的DNA,以提取的DNA为模板PCR法检测重组质粒目的片段整合基因组的情况。主要结果及结论:1.阳性克隆PCR、酶切鉴定和基因测序结果表明成功构建真核表达载体pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66,免疫荧光和Western blot检测结果表明该质粒能够在哺乳动物细胞中成功表达具有生物学活性的Nogo-GMCSF融合蛋白。2.用脂质体为免疫佐剂制备Nogo-GMCSF复合核酸疫苗,通过血清抗体效价检测获得脂质体与重组质粒pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66的最佳体积比为1:1。3.成功制备Nogo-GMCSF复合核酸疫苗制剂,免疫动物,并在免疫期间检测动物检测各组动物血清的抗体效价,发现Nogo-GMCSF复合核酸疫苗能够在动物体内产生有效的抗体,GMCSF作为免疫佐剂因子能够有效增强机体免疫反应。4.成功制备脊髓左侧半横切损伤模型,中枢神经功能评价发现:Nogo-GMCSF复合核酸疫苗能够促进左后肢运动功能的恢复及修复受损的脊髓;行为学、组织学、分子水平的检测结果表明Nogo-GMCSF复合核酸疫苗接种产生的抗体,能够有效封闭Nogo蛋白的两个主要功能区域,阻断由Nogo介导的抑制神经再生相关信号的传递,进而促进受损脊髓修复和运动能力的恢复。5.重组质粒pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66整合基因组检测结果表明,连续免疫6周后,在最后一次免疫后第6周检测重组质粒基因片段整合到动物基因组的情况,PCR的实验结果仍为阴性,所以该核酸疫苗不存在外源基因整合到动物基因组的情况。
【关键词】：Nogo GMCSF 核酸疫苗 脊髓损伤 轴突再生
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2;R392
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 英文缩写标注10-14
• 绪论14-21
• 1 髓磷脂相关抑制因子Nogo14-18
• 2 GMCSF在免疫应答及中枢神经系统损伤修复中的作用18-19
• 3 核酸疫苗在脊髓损伤免疫治疗中的应用19-21
• 第一章真核表达载体pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66的构建与鉴定21-46
• 1 实验材料21-26
• 1.1 载体21
• 1.2 菌株21
• 1.3 细胞系21
• 1.4 主要试剂21-22
• 1.5 引物合成和DNA序列测定22-23
• 1.6 主要实验仪器23-24
• 1.7 主要试剂配制24-26
• 2 实验方法26-39
• 2.1 DH5α 感受态细胞制备26-27
• 2.2 真核表达载体pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66的构建27-36
• 2.3 真核表达载体pc DNA-GNCSF-Nogo N-Nogo66鉴定36-39
• 3 实验结果39-45
• 3.1 目的基因扩增39-41
• 3.2 阳性克隆鉴定41-44
• 3.3 重组质粒pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66的体外表达检测44-45
• 4 实验结果分析45-46
• 第二章 Nogo-GMCSF复合核酸疫苗对脊髓损伤免疫治疗效果评价46-80
• 1 实验材料46-50
• 1.1 质粒46
• 1.2 实验动物46
• 1.3 主要实验仪器46-47
• 1.4 主要实验试剂47-48
• 1.5 主要实验试剂配制48-50
• 2 实验方法50-64
• 2.1 Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的制备50-51
• 2.2 疫苗制剂确定51-52
• 2.3 Nogo-GMCSF复合核酸疫苗免疫动物52
• 2.4 Nogo-GMCSF复合核酸疫苗体内抗体效价检测52-53
• 2.5 SD大鼠变态反应性脑脊髓炎发生率检测53
• 2.6 动物模型的制备53-54
• 2.7 行为学方法评价Nogo-GMCSF复合核酸疫苗对脊髓损伤的治疗效果54-56
• 2.8 组织学方法评价Nogo-GMCSF复合核酸疫苗对脊髓损伤的治疗效果56-60
• 2.9 Nogo在免疫部位肌肉组织的表达60-61
• 2.10 免疫组化检测脊髓Nogo与GAP-43的表达61-62
• 2.11 Nogo-GMCSF复合核酸疫苗体内外源基因整合情况检测62-63
• 2.12 数据统计分析63-64
• 3 实验结果64-79
• 3.1 Nogo-GMCSF复合核酸疫苗免疫条件确定64
• 3.2 Nogo在免疫部位肌肉组织的表达情况64-65
• 3.3 Nogo-GMCSF复合核酸疫苗产生的抗体效价65-66
• 3.4 行为学检测结果66-71
• 3.5 组织学检测结果71-74
• 3.6 免疫组化检测74-76
• 3.7 变态反应性脑脊髓炎的发生率76-77
• 3.8 外源基因整合情况检测结果77-79
• 4 结论79-80
• 讨论80-83
• 全文总结83-84
• 参考文献84-89
• 致谢89-90
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果90

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈开廷;王永堂;舒亚海;肖岚;鲁秀敏;;以髓磷脂相关抑制因子及其受体为靶点的脊髓损伤免疫治疗策略研究[J];生命科学;2015年02期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 邹苏琪;成年斑马鱼视神经损伤后轴突再生与髓鞘再建的研究[D];中国科学技术大学;2013年

2 霍妍;Nogo氨基末端在视神经再生中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 刘宁;嗅鞘细胞移植治疗大鼠马尾神经压迫损伤的初步研究[D];第二军医大学;2013年

2 胡婧楠;轴突生长抑制蛋白在听觉剥夺大鼠听皮层中的表达及其对听皮层可塑性调控作用的实验研究[D];河北医科大学;2014年

  本文关键词：Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：266043