慢性间断性酒精暴露大鼠不同脑区MMP-9的表达及突触超微结构的改变

发布时间：2020-05-13 00:32

【摘要】：目的:通过建立慢性酒精暴露的大鼠模型,应用实时荧光定量PCR,蛋白质免疫印迹(Western blot),透射电镜和IP-MS技术等实验手段,观察成瘾与学习记忆相关脑区(海马、内侧前额叶皮层和杏仁核)基质金属蛋白酶MMP-9的表达情况以及这些脑区突触超微结构的改变,并通过寻找MMP-9相互作用蛋白,探讨MMP-9在慢性酒精暴露过程中的作用及可能机制,为进一步揭示酒精暴露导致的成瘾记忆和行为提供新的理论依据。方法:将七周龄的雄性大鼠随机分为以下三组:酒精组(EtOH)、麦芽糖组(Maltose)、自由饮食对照组(Chow)。对大鼠给予间断性灌胃,连续灌胃两天,戒断两天,依此类推,直至第28天。酒精组每天灌酒精(4 g/kg)、麦芽糖组每天灌同酒精组相等热量的麦芽糖(7 g/kg)、自由饮食对照组每天自由饮水。然后在模型建立过程当中的7个时间点(第0、2、4、14、16、26、28天)取海马、mPFC和杏仁核组织进行后续实验:(1)血液酒精浓度和体重测定:在灌胃后30 min内采用大鼠尾静脉取血的方法取少量新鲜血液0.2 ml,随后立即用顶空气相色谱法测定血液中酒精浓度。(2)用实时荧光定量PCR的方法测定大鼠海马、mPFC、杏仁核组织在CIE的不同阶段MMP-9 mRNA的表达量。(3)用蛋白质免疫印迹Western Blot的方法测定大鼠海马、mPFC、杏仁核等组织在CIE的不同阶段MMP-9蛋白的表达量。(4)利用透射电镜观察经慢性间断性酒精暴露后,海马、mPFC、杏仁核突触的界面结构较对照组的改变情况。(5)用IP-MS/MS方法分析在CIE模型中海马脑区与MMP-9相互作用的蛋白。结果:(1)建立慢性间断性酒精暴露模型,对酒精组大鼠在连续灌胃两天后、戒断两天后的同一时间点(每次灌酒精选取相同时间点),即在初始灌酒精第2天、第4天、第14天、第16天、第26天、第28天,进行尾静脉采血测定血酒精浓度(blood ethanol concentration,BEC)。结果显示,与对照组相比,当天灌酒精组血酒精浓度明显升高(P0.01)。在整个模型建立期间,三组大鼠体重都逐渐增高,各组之间没有显著差异。表明模型建立成功。(2)荧光定量PCR实验结果显示,与对照组相比,在海马组织中,MMP-9的mRNA表达量从酒精急性暴露阶段即Day 2开始增高(P0.01),在慢性酒精暴露早期即Day 14(P0.01),在慢性酒精暴露晚期即Day 26(P0.01),MMP-9的mRNA表达也呈升高状态。同时,在酒精戒断阶段即Day 4、Day 16、Day 28三个时间点,MMP-9 mRNA的表达量同样升高(P0.05)。在mPFC中,MMP-9 mRNA的表达量也出现类似的从Day 2开始持续到Day 28的升高的情况,在Day 2(P0.05)、Day 4(P0.05)、Day 14(P0.05)、Day 16(P0.05)、Day 26(P0.05)、Day 28(P0.05)。在杏仁核脑区,MMP-9 mRNA的表达量较对照组均无显著差异。但是,在杏仁核中检测到MMP-2的mRNA表达量较对照组有升高。在麦芽糖组中,三个脑区的七个时间点的检测显示,MMP-9 mRNA的表达量与对照组相比无显著差异。(3)蛋白质免疫印迹(Western blot)的结果显示,与Day 0相比,海马组织中Total MMP-9及其活性形式Active MMP-9的蛋白表达量从急性戒断期即Day 4开始明显升高(P0.05),逐步上升并一直持续到Day 28(P0.01)。在mPFC中,与Day 0相比,Total MMP-9的蛋白表达从慢性暴露的早期(Day 14)开始明显增高(P0.01)。在慢性戒断的早期(Day 16)(P0.05),在慢性暴露的晚期(Day 26)(P0.01)和慢性戒断的晚期(Day 28)(P0.01)均明显升高。Active MMP-9的蛋白表达在慢性暴露的早期(Day 14)最早出现明显升高(P0.05),而后在慢性暴露和戒断的晚期明显升高即Day 26(P0.05)、Day 28(P0.01)。(4)透射电镜结果显示,与对照组即Day 0相比,在CIE酒精暴露后期的海马、mPFC、杏仁核这三个脑区均有突触界面曲率增大,突触后膜致密物厚度增加,突触前后膜之间的间隙增大的现象。(5)通过蛋白质免疫共沉淀及质谱分析方法筛选找到,在慢性酒精间断性暴露期间与MMP-9发生相互作用的一些蛋白,包括Itgb1、Src、Eef1a、微管蛋白(Tubulin)、肌动蛋白(Actin)和组蛋白H2B(Histone H2B)等。结论:(1)在大鼠海马和mPFC组织中,慢性酒精间断性暴露后MMP-9的mRNA和蛋白表达量均明显升高,而在杏仁核中MMP-9的表达量无显著性差异。同时,MMP-2的mRNA表达在杏仁核中有升高。(2)慢性酒精间断性暴露导致大鼠海马、mPFC、杏仁核等脑区神经元突触超微结构突触界面曲率增大、突触后膜致密物厚度增加、突触间隙增大。(3)我们找到一些在慢性酒精暴露过程中MMP-9的相互作用蛋白,为下一步的分子机制研究提供了实验基础。
【图文】：

实验流程,酒精浓度

用于后续 Real time-PCR 和 Western blot实验。实验流程如下图 1 所示：图 1 实验流程图1.3.2 血酒精浓度的测定用 10 %水合氯醛 350 mg/kg 腹腔注射麻醉，用干净的刀片切割大鼠尾部约 3mm 处，，收集血液约 0.2 ml 后离心分离获得血清，立即用顶空气相色谱仪进行血液酒精浓度的测定。1.3.3 荧光定量 PCR（1）取材分离出大鼠海马、前额叶皮层、杏仁核组织，放入无酶 EP 管后立即放入液氮速冻，然后存放到-80℃冰箱中备用。（2）总 RNA 提取按照总 RNA 抽提纯化试剂盒的说明来提取各组不同脑区

酒精浓度,酒精,大鼠

山西医科大学硕士学位论文2 结果2.1 慢性间断性酒精暴露模型（CIE）的建立在慢性酒精暴露期间，酒精组大鼠在灌胃后半小时内测得的血酒精浓度和对照组大鼠的血酒精浓度见图 1-1a，结果显示实验组大鼠灌酒精后平均血酒精浓度为 80mg/dl，而对照组检测不到酒精，提示模型建立成功。图 1-1b 记录了在造模期间各组大鼠体重的变化情况，三组相比较无显著差异。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R749.6

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