纳米颗粒雷帕霉素黏附的胶原纤维多聚复合物补片抑制静脉新生内膜增生

发布时间：2020-05-13 11:45

【摘要】：心血管疾病的发病率逐渐增高,在2010年,美国心脏学会统计,出院确诊的患者中,心血管疾病患者占第一位达到5.8百万,远高于排在第十位的肿瘤患者的1.6百万。这些患者中很多需要进行球囊扩张,支架植入及行转流手术。正因为动脉疾病的高发病率,所以大量的实验研究了植入动脉循环系统的支架,静脉移植物,人工血管材料的愈合过程和机制。新生内膜的增生是一个不可避免的病理生理过程,造成移植物管腔的狭窄,更严重的情况造成管腔堵塞而造成移植物失败,对患者造成严重的痛苦。现在随着医学的发展,人们正在寻找各种方法抑制移植物内膜的增生,包括如药物洗脱的支架及人工移植物,并在动物实验及临床试验中取得了良好的效果。随着纳米科技的发展,在动物试验中,应用纳米科技来抑制新生内膜增生在动物试验中也取得了较好的效果。与之相反,在静脉系统,需要进行支架植入及进行转流手术相对较少。但在某些严重的下腔静脉损伤,某些肿瘤侵犯下腔静脉,有必要进行下腔静脉的修复或是行转流手术。因为静脉系统是一个低流速的系统,血栓形成的风险较大,并且为了避免静脉系统的狭窄,所以了解静脉系统新生内膜的形成并抑制静脉新生内膜增生极为重要。牛心包补片在血管外科手术中现在已经广泛应用,但在静脉系统中的愈合机制还不清楚;纳米颗粒雷帕霉素能否粘附在牛心包补片上也不清楚;这种粘附了纳米颗粒雷帕霉素的牛心包补片能否抑制新生内膜的增生,是否会对愈合过程造成负性影响还未得到探索。所以我们建立了一个大鼠的下腔静脉静脉切开模型,行牛心包补片修补术,研究静脉系统新生内膜形成的过程及变化;并制作纳米颗粒雷帕霉素,研究其是否能成功的粘附在牛心包补片上;然后把粘附了纳米颗粒雷帕霉素的补片修补大鼠的下腔静脉,了解能否抑制静脉新生内膜增生及研究其机制。目的:1.了解牛心包补片修补大鼠下腔静脉的愈合过程及机制;2.检验纳米颗粒雷帕霉素能否成功的粘附在牛心包补片上;3.探索粘附了纳米颗粒雷帕霉素的牛心包补片能否有效抑制新生内膜增生。方法:选取6-8周的成年雄性Wistar大鼠(250-350g),共91只,修补下腔静脉组32只大鼠,植入皮下组12只大鼠,补片在第1,3,7,30天取出,了解下腔静脉补片修补术的愈合机制及过程。纳米颗粒雷帕霉素组16只大鼠,纳米颗粒空白对照组16只,用于纳米颗粒rhodamine的15只。补片在第7,30天取出;运用HE,免疫组化,免疫荧光和Western blot方法,了解纳米颗粒雷帕霉素能否有效抑制静脉新生内膜增生。结果:1.在第7天,在补片管腔面出现新生内膜;与第7天相比,在第30天新生内膜逐渐增厚(p0.0001)。2.与第7天相比,第30天的内皮化比例较高(p=0.0048);内膜中的平滑肌的平均密度没有明显变化(p=0.9224);间充质细胞数量减少(p=0.001),巨噬细胞(p=0.0001)和白细胞比例减少(p0.0001)。内皮祖细胞,平滑肌祖细胞和静脉祖细胞参与了新生内膜的形成。3.平滑肌细胞和巨噬细胞表达VCAM,ICAM和CD29等细胞识别和黏附因子。4.与第7天相比,第30天处于增生状态的细胞数量显著下降(p0.0001);处于凋亡状态的细胞比例没有明显变化(p=0.7383)。5.在第天和第30天,新生内膜的内皮细胞,平滑肌细胞表达Eph-B4。与第7天相比,第30天新生内膜表达大量胶原纤维(p=0.0001),但不表达弹力纤维。在第7天和第30天内膜中少量细胞表达Ephrin-B2,但内膜内皮细胞不表达Ephrin-B2。6.与第7天相比,在第30天,MMP-2,MMP-3和MMP-4的表达减少(p=0.0011,p=0.0074,p=0.043)。7.电镜图片显示纳米颗粒粘附在牛心包补片的胶原纤维素上,雷帕霉素的释放可以维持大约3周的时间。8.纳米颗粒雷帕霉素组和纳米颗粒空白对照组相比,在第7天,内膜和外膜的厚度显著降低(p=0.0010,p=0.0010),但纳米颗粒空白对照组和对照组没有明显差异(p=0.0787)。在第30天,内膜和外膜的厚度显著降低(p=0.0046,p=0.0026),但纳米颗粒空白对照组和对照组没有明显差异(p=0.5921)。纳米颗粒雷帕霉素组和纳米颗粒空白对照组的重新内皮化比率没有明显差异(p=0.5914,p=0.8025)。9.在纳米颗粒雷帕霉素组,与纳米颗粒空白对照组相比,在第7天和第30天,有较少的CD68阳性细胞(p=0.0028,p=0.0248),平滑肌细胞平均密度显著降低(p=0.0103,p=0.0093)。在纳米颗粒雷帕霉素组,与纳米颗粒空白对照组相比,在第7天有较少的细胞处于增生状态(p=0.0039),并且有较少的平滑肌细胞处于增生状态(p=0.0018);在第30天,处于增生状态的细胞比例没有明显差异(p=0.1883)。在第7天和第30天,处于凋亡状态的细胞没有明显差异(p=0.7338,p=0.7118)。10.纳米颗粒Rhodamine主要在肝肾代谢,其它组织中较少。纳米颗粒Rhodamine在牛心包补片上24小时后还能检测到。结论:1.在牛心包补片修补大鼠下腔静脉切开术中,不同种类的成熟细胞和祖细胞参与了静脉新生内膜的形成;不同细胞的比例在不同时间有不同的变化;在不同时间,处于增生状态的细胞比例也不相同。不同种类细胞所表达的蛋白也处于变化中。2.不同的细胞间分子介导了细胞间的识别和粘附。3.在静脉新生内膜形成过程中,新生内膜得到了一个类似正常静脉内膜的结构和分子标志。4.纳米颗粒雷帕霉素可以成功的粘附在牛心包补片上。5.粘附了纳米颗粒了雷帕霉素的牛心包补片可以显著抑制静脉新生内膜的增生。
【图文】：

第一,白细胞

在第30天，有较少的阳性细胞（图6A，，第一列）；与第7天相比，在新生内膜中，第30天有显著减少的巨噬细胞（p=0.0001，图6B,第一个条状图）。在第7天和第30天，在新生内膜中都可发现有CD45阳性细胞(图6A,第二列), 与第7天相比，在新生内膜中，第30天有显著减少的白细胞 (p<0.0001，第二个条状图)。

内皮细胞,连续性,纳米颗粒,雷帕霉素

在第7天和第30天，在新生的内膜表面，都有CD31阳性的细胞表达(图20A)；内皮细胞的连续性在这两组中间，在第7天和第30天没有显著性的差异 (p=0.5914, p=0.8025) (图20B)。在第7天和第30天，纳米颗粒和纳米雷帕霉素并不影响内皮祖细胞（图20C,上排）；静脉内皮祖细胞（图20C,中排）；新生内膜成熟内皮细胞的静脉特征（图20C，下排）。3.2 纳米颗粒黏附的牛心包补片不影响内膜的内皮化
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363

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