孢子丝菌特异性检测抗原的筛选及菌体杀灭方法的构建

发布时间：2020-05-13 16:26

【摘要】：孢子丝菌病是由双相真菌孢子丝菌引起的一种常见皮肤疾病,目前在世界各地均有分布,在我国东北三省特别常见。病变通常局限于皮肤、皮下细胞组织和邻近淋巴管。也可传播到其他器官,罕见情况下,吸入分生孢子会导致人体系统性疾病,严重时甚至对人体生命构成威胁。目前针对孢子丝菌病的研究主要集中在基因分型,流行病学和药物敏感性等方面。该疾病临床诊断主要依靠1,3-β-D-葡聚糖试验(G试验)、半乳甘露聚糖(GM)试验、培养法以及病理组织染色等,其方法灵敏度和特异性较差,确诊时间较长,急需一种简单快速,灵敏度高的血清诊断技术与相应产品,以满足临床对该疾病的快速检测需求。目前已报道的我国孢子丝菌病的常见致病菌株有申克氏孢子丝菌、巴西孢子丝菌、球形孢子丝菌三种,但我国尤其是东北三省其临床主要致病菌株尚无法确定,针对致病菌的特异性检测抗原也有待挖掘。因此,本研究主要目标有三个,其一为确定所获得的临床病人血清样本中的主要致病菌类型及其抗原;其二,针对上述致病菌及抗原特点,通过多种手段开发并制备可与孢子丝菌病患者血清中抗体结合的抗原,并用于孢子丝菌病快速检测方法的构建中。其三,为了有效预防控制此病的传播,加速患者康复进程,需要开发有效的杀菌系统对此菌有高效的杀灭作用。当前致病菌抗原制备大多以原核表达为主,主要考虑到系统表达稳定且易于大批量制备的特点。我们首先以世界范围内孢子丝菌病流行性最广,研究最为深入的申克氏孢子丝菌为代表菌株,调取其特异性抗原gp70基因,同时构建pET-28a(+)和pET-43.1两种原核表达体系,分别转化表达菌株BL21和Rosetta,并使用Bradford法测定表达蛋白浓度。结果显示BL21菌株的蛋白表达量高于Rosetta。进一步大量诱导表达gp70-His和gp70-TEV-NusA-His两种蛋白,后者经TEV酶切后分离效率较低。使用大量表达的gp70-His蛋白通过间接ELISA方法和Western Blotting检测表达抗原的特异性,结果显示原核表达的gp70抗原与病人血清样本中抗体的结合缺乏特异性。考虑到孢子丝菌为真核生物,原核系统表达可能因缺乏蛋白的空间折叠和糖基位点的修饰从而影响了正确抗原表位的形成,后续工作考虑使用具有蛋白翻译后修饰功能的真核表达体系。进一步实验中构建了 gp70-TEV-His-pPICZalphaB的重组质粒,成功转化毕赤酵母X-33,表达的糖蛋白抗原经血清学进行验证,发现仍然存在特异性及灵敏性不足的问题,此结果侧面反应我国东北三省主要流行的孢子丝菌病并非由申克氏孢子丝菌所导致,且其抗原特性与申克氏菌不一致。为此,进一步实验设计中,直接提取从临床孢子丝菌病患者分离得到的孢子丝菌天然抗原,并对其进行鉴定。由于酵母相孢子丝菌的细胞壁结构致密,单一方法难以完成。最终采用物理方法结合酶解技术,使嵌在细胞壁的糖蛋白得以释放。通过蛋白提取物与孢子丝菌病患者血清抗体的结合,经SDA-PAGE以及Western Blotting分析,我们发现该抗原大小为80KD。通过生物信息学分析发现此蛋白三维结构与gp70存在一定差异。进一步通过序列比对发现,80KD蛋白序列与NCBI数据库中的球形孢子丝菌具有高度序列相似性。为了达到预防、控制病源传播的目的,需要有效的杀菌系统对此菌进行高效杀灭。传统紫外灯含有大量汞,对环境的污染不可逆,我们通过电子激励束研制无汞光源并用于物体表面杀菌。通过对已发表的杀菌文献调研,开发的新型杀菌系统使用较低辐照剂量具有明显的杀菌效果,此剂量低于Mohr,H.和Gravemann,U.使用300 mJ/cm~2(3.0×10~3 mW·s/cm~2)辐照计量杀灭血小板浓缩物中的10种菌,并且同时我们对杀菌机理做了进一步研究。综上所述,我国东北三省孢子丝菌病的主要致病菌类型为球形菌。通过物理方法结合酶解技术提取的临床分离株80KD纯化抗原与gp70蛋白比对,三维结构存在差异。该80KD蛋白对病人血清抗体显示出高度亲和力和良好的特异性,从而为下一步临床孢子丝菌检测试剂的开发奠定了基础。除此之外我们还探究了深紫外对表面孢子丝菌的杀灭效果,为预防孢子丝菌病提供了可参考资料。
【图文】：

重组质粒,菌落,测序,条带

ｏｔｔｉｎｇ邋检测逡逑ｂａ－Ｆｉｅｒｒｏ文献［１１３］。逡逑的构建逡逑＋）邋－ｇｐ７０－Ｈｉｓ重组质粒的构建逡逑８ａ邋（＋）邋－ｇｐ７０－Ｈｉｓ连接产物，按照２３图２．３所示。图中泳道２显示出６４００邋期条带大小相符。对比未经酶切的质邋）和ｇｐ７０－Ｈｉｓ重组成功。进一步实验并转化感受态细胞。使用菌落ＰＣＲ确重组质粒进行测序，确认重组质粒１逦２邋Ｍ逡逑

重组质粒,条带,质粒

２．４＿１．２邋重组质粒邋ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ邋的构建逡逑取丨００叩口￡丁哪７０－１￡￥－灿５八－１＾连接产物，按照２．３．１．２所述实验方法进逡逑行重组质粒的酶切，结果如图２．４所示。图中泳道２显示出７９００邋ｂｐ与１２００邋ｂｐ逡逑两条分子量不同的条带，与预期条带大小相符。对比未经酶切的质粒现实的单逡逑一条带，初步说明ｐＥＴ－４３．１和ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ重组成功。进一步实验中，逡逑使用２．３．１中所述方法进行连接反应并转化感受态细胞。使用菌落ＰＣＲ确认阳逡逑性克隆后（此部分数据未展示），提取重组质粒进行测序，确认重组质粒基因序逡逑列完全正确。逡逑ＪｊｍＵ｜５０００ｂｐ逡逑３１０００逡逑图２．４邋ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ重组质粒双酶切验证逡逑１：未经酶切的ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ重组质粒；２：经ＢａｍＨＩ和Ｈｉｎｄｌｌｌ酶切后的逡逑ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ邋重组质粒；３：核酸邋Ｍａｒｋｅｒ逡逑２．４．２重组蛋白表达逡逑将已确定分别转入邋ｐＥＴ２８ａ邋（＋）邋－ｇｐ７０－Ｈｉｓ，，邋ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ邋质粒逡逑的阳性菌株按照２．３．２．Ｉ方法进行蛋白的诱导表达。分别取未诱导菌体、诱导后逡逑上清、诱导后沉淀及破碎悬液，使用２３．２．４方法进行电泳检测，结果如２．５所逡逑示。通过图中可在４３邋ＫＤ左右见到明显诱导条带，说明蛋白诱导表达成功。逡逑使用上述同样方法进行ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ质粒的诱导表达，结果如逡逑图２．６所示。通过图中可在９７邋ＫＤ左右见到明显诱导条带
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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