hTK1基因修饰内皮祖细胞对MCT诱导大鼠肺高压模型的干预研究

发布时间：2020-05-13 16:50

【摘要】：肺动脉高压(PAH)是肺血管阻力进行性增加,肺动脉压力持续增高,影响心肺功能和心输出量,引起活动受限和寿命缩短的病理综合征。目前的特异性靶向药物治疗能改善病情,但作用有限。内皮祖细胞(EPCs)联合基因治疗是未来的新方向。EPCs具有归巢至血管损伤部位,分化为成熟内皮细胞,形成血管等生物特性,同时也是具有促进EPCs生理功能,表达有功能蛋白的基因的载体。二者共同作用以达到改善血管重塑的目的。本文以众多的基因修饰EPCs的治疗为参考,在野百合碱(MCT)诱导的大鼠PAH模型中研究预防性静脉注射人组织激肽释放酶1(hTK1)基因转染的同源EPCs对PAH的血流动力学、病理改变的影响。从而为PAH的细胞生物学治疗提供一些科学依据。研究目的观察静脉注射转染人组织激肽释放酶(hTK1)基因的同源内皮祖细胞(EPCs)对野百合碱(MCT)诱导的大鼠肺动脉高压(PAH)血流动力学,血清一氧化氮(NO)水平和肺小动脉病理改变的影响。研究方法1、细胞实验:(1)密度梯度离心法分离提取雄性Wistar大鼠骨髓单个核细胞,EGM-2完全培养基培养;(2)通过观察细胞生长特性,吞噬红色荧光标记乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)及结合异硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)的荧光检测,鉴定骨髓源性单个核细胞(BMMNCs)为EPCs;(3)携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)梯度转染EPCs,观察细胞生长活性和荧光显示情况,获得该腺病毒对EPCs的最佳转染复数(MOI);(4)CCK8细胞增殖实验和划痕愈合实验观察携带hTK1基因的腺病毒(Ad-hTK1)转染对EPCs增殖、迁移能力的影响;(5)检测Ad-hTK1转染EPCs细胞裂解液中一氧化氮(NO)含量;(6)Western blotting检测Ad-hTK1转染EPCs中人组织激肽释放酶(hTK1)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达情况。2、动物实验:(1)7-8周雄性Wistar大鼠30只随机分为正常对照组6只(NC组),和1%MCT溶液腹腔注射建立的PAH模型组。模型组再随机分为3组,每组8只,于MCT注射3天后分别颈静脉注射磷酸盐缓冲液(MCT+PBS组)、同源EPCs(MCT+EPCs组)或转染hTK1基因的EPCs(MCT+Ad-hTK1-EPCs组),注射细胞数量约为106/次(以0.5ml PBS混匀),连续注射两天;(2)实验前和造模2周、4周对四个动物组进行心脏超声检查,动态监测的超声参数包括右室前壁厚度(RVAWT)、肺动脉内径(PAD)、主动脉内径(AOD)、肺、主动脉内径之比(PAD/AOD)、肺动脉加速时间(PAAT)、肺动脉射血时间(PAET)、肺动脉加速、射血时间之比(PAAT/PAET)、右室舒张末横径(RVEDD)、右室舒张末纵径(RVEDL)、右室舒张末横径、纵径之比(RVEDD/RVEDL)、三尖瓣环收缩期位移(TAPSE)、左室射血分数(LVEF);(3)检测实验前和造模2周、4周四个组血清NO水平;(4)最后一次心脏超声检查后,右室置管测肺动脉压,记录肺动脉收缩压(PASP)、肺动脉平均压(PAMP)、右室压力上升速率dp/dtmax和下降速率dp/dtmin;(5)右室测压后取材心肺器官,测量右心室肥厚指数(RVHI),肺组织石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色测量血管外径100-200μm的肺小动脉管壁厚度指数(WT%)、管壁面积指数(WA%);(6)Western blotting检测肺组织hTK1、eNOS蛋白表达情况;(7)Ad-GFP-EPCs静脉移植入MCT腹腔注射7天后的两只大鼠体内,2天后取材,冰冻切片观察EPCs在心、肝、脾、肺、肾中分布情况。研究结果:1、细胞实验结果:(1)骨髓单个核细胞经培养和诱导分化,原代细胞4天贴壁,7天出现细胞集落,14-21天可传代,传代细胞仍可见细胞集落,3-7天传代一次,随着传代次数增加,集落变小,逐渐消失,细胞增殖分化类似内皮细胞;(2)Dil-acLDL、FITC-UEA-I双阳性染色鉴定BMMNCs为正在分化的EPCs;(3)按MOI=0,25,50,100,150,200,250将Ad-GFP转染入EPCs,在MOI=150时细胞荧光显示最好,且细胞生长活性不受影响,因而确定最佳MOI=150;(4)CCK8细胞增殖实验和划痕愈合实验结果分别显示Ad-hTK1转染EPCs(Ad-hTK1-EPCs)的吸光度值A450、划痕48小时后愈合面积均大于未转染EPCs(EPCs)和转染了对照病毒Ad-GFP 的EPCs(Ad-GFP-EPCs),提示Ad-hTK1转染增强了细胞的增殖活性和迁移能力(P0.05);(5)Ad-hTK1-EPCs细胞裂解液中NO含量高于EPCs和Ad-GFP-EPCs(P0.05);(6)Ad-hTK1-EPCs稳定表达hTK1蛋白,eNOS蛋白表达水平高于EPCs和Ad-GFP-EPCs(P0.05)。2、动物实验结果:(1)与NC组比较,模型组大鼠一般状况较差,存活数减少,造模2周、4周的体重增加减少。其中2周时体重增加数值比较,MCT+PBS组、MCT+EPCs组和NC组间差异有统计学意义(P0.05),MCT+PBS组和MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P0.05);(2)四个动物组超声心动图参数比较,随着时间延长,PAH模型组特别是MCT+PBS组、MCT+EPCs组的RVAWT、PAD/AOD、RVEDD/RVEDL测算值逐渐增大,PAAT、PAAT/PAET、TAPSE测算值逐渐减小。MCT+PBS组PAD/AOD、PAAT、PAAT/PAET、RVEDD/RVEDL的测算值与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P0.05);MCT+EPCs组的PAAT、PAAT/PAET测算值与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P0.05);(3)四组动物实验前,造模2周、4周血清NO变化情况为MCT+Ad-hTK1-EPCs组血清NO含量持续增高,与其他3组间差异有统计学意义(P0.05);MCT+PBS组血清NO含量持续降低,2周时测值和其他3组间差异有统计学意义(P0.05),4周时与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P0.05);MCT+EPCs组血清NO含量2周时升高,高于NC组和MCT+PBS组,低于MCT+Ad-hTK1-EPCs组(P0.05),4周时降低,与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P0.05);NC组血清NO含量4周时增高但低于MCT+Ad-hTK1-EPCs组(P0.05);(4)右室测压显示模型组PASP、PAMP和dp/dtmax、dp/dtmin升高,MCT+PBS 组的 PASP、PAMP 和 dp/dtmax、dp/dtmin 测值与 NC 组和MCT+Ad-hTK1-EPCs组测值间差异有统计学意义(P0.05),MCT+EPCs组的PASP、dp/dtmax测值与NC组测值间差异有统计学意义(P0.05);(5)模型组RVHI增大,肺小动脉WT%和WA%增大,MCT+PBS组改变明显,与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有或近似有统计学意义(P0.05,P≈0.05);(6)四组动物肺组织蛋白表达情况显示MCT+Ad-hTK1-EPCs组表达hTK1、eNOS蛋白;(7)Ad-GFP-EPCs的绿色荧光在大鼠心、肝、脾、肺、肾中都可见,心脏分布较少,并且主要分布在各器官的血管壁、血窦等部位。结论和意义:hTK1基因修饰EPCs增殖活性和迁移能力增强,Ad-hTK1-EPCs稳定表达hTK1、eNOS蛋白和释放NO产物;静脉移植Ad-hTK1-EPCs改善MCT诱导的大鼠PAH血流动力学和病理改变,与预防性干预策略在PAH发生早期提高了血清NO含量可能有关。
【图文】：

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逦ｍ邋ｉ邋Ｍ逡逑Ｍ邋『一＿逡逑图１Ａ－Ｂ示分离出的股骨、胫骨，尽量将下肢骨剥离干净并注意无菌操作；图１Ｃ逡逑是用大鼠骨髓源性单个核细胞分离液进行密度梯度离心后骨髓冲洗液的分层，红逡逑箭头所示为第三层，单个核细胞层。逡逑ａ逦ｂ逦ｃ逡逑ｄ逦ｅ逦ｆ逡逑９逦ｈ逦ｉ逡逑图２示倒置显微镜明场４０ｘ邋（ａ／ｃ／ｅ／ｇ／ｈ），ｌＯＯｘ邋（ｂ／ｄ／ｆ／ｉ）原代细胞培养不同时间（ａ逡逑－ｂ，４天；ｃ－ｄ，邋７天；ｅ－ｆ，，邋１４－２１天）和传代细胞（ｇ，ｈ，ｉ）所见细胞形态。原代逡逑细胞４天贴壁和开始生长；７天开始出现细胞集落；１４－２１天集落融合，可以传代，逡逑细胞呈“铺路石”样；传代细胞可见较小细胞集落，集落外细胞生长类似内皮细胞，逡逑３５逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R544.1;R-332

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本文编号：2662247