Mycn突变角膜混浊小鼠角膜病变特点及机制的研究

发布时间：2020-05-13 23:30

【摘要】：盲和视力受损是世界范围内严重的公共卫生、社会和经济问题。在我国,由角膜病引发的角膜混浊是致盲的重要原因,仅次于白内障。此前,本实验室通过乙烷基亚硝基脲(ENU)诱导小鼠突变的方法获得一例在C57BL/6(B6)背景下,突变杂合子表现为角膜混浊表型小鼠,突变基因鉴定发现该角膜病是由Mycn基因编码区第1217位碱基(bp)处发生单个碱基转换(T转换为C),导致MYCN蛋白第406位氨基酸由V(缬氨酸)转变为A(丙氨酸)引起,故将该突变小鼠命名为Mycn V406A,另外遗传实验发现该小鼠突变纯合子致死。故本文以MycnV406A突变杂合子(Mycn V406A/+)小鼠为研究对象,从以下三个部分开展研究:1、Mycn V406A角膜混浊小鼠遗传实验及角膜组织学分析将Mycn V406A/+小鼠与野生型B6小鼠配种,观察后代小鼠表型并进行基因型鉴定。结果发现在66只后代小鼠中有31只MyctnV406A/+基因型小鼠,其中20只表现为角膜混浊,4只具有明显小眼表型,7只正常表型。在20只确定为角膜混浊的小鼠中,9只小鼠初生时(P0)出现眼睑开放表型。故将Mycn V406A/+角膜混浊小鼠分为出生后眼睑开放型和闭合型两种类型。对6-8周(W)小鼠眼球H.E染色发现:(1)相比于野生型小鼠,眼睑开放型小鼠角膜上皮局部增厚,角膜基质层常见新生血管及少量炎性细胞;(2)眼睑闭合型小鼠角膜上皮略微变薄,角膜基质层偶见新生血管。2、Mycn V406A突变对小鼠角膜上皮细胞分化的影响分析筛选出6-8 W出生后眼睑开放型与闭合型角膜混浊小鼠,设同窝野生型小鼠对照。采用免疫组织化学技术对小鼠角膜上皮细胞keratin 12(Krt12)、keratin 14(Krt14)、keratin 10(Krt10)的表达情况进行检测。结果发现:(1)野生型小鼠角膜上皮所有细胞Krt12组化结果呈阳性、Krt10呈阴性,基底层少许细胞Krt14呈弱阳性;(2)眼睑开放型小鼠角膜上皮细胞局部Krt12组化结果为阴性、除表层少许细胞外Krt14表达水平异常升高、局部异常表达Krt10;(3)眼睑闭合型小鼠角膜上皮细胞Krt12及Krt10组化结果未见明显异常,而Krt14表达与眼睑开放型相似。正常小鼠于胚胎期16.5天(E16.5)眼睑发生闭合,为了确定出生后眼睑闭合型角膜混浊小鼠表型及角膜上皮细胞分化异常是否由胚胎期小鼠眼睑闭合延迟直接引起,继续对E16.5眼睑开放比例进行统计并对MycnV406A/+E16.5小鼠眼区进行H.E和免疫组织化学分析。结果发现:(1)遗传统计发现E16.5眼睑开放小鼠比例类似于角膜混浊小鼠比例,且高于初生时眼睑开放小鼠比例,提示部分小鼠眼睑闭合延迟并于出生前闭合;(2)与野生型小鼠相比,MycnV406+E16.5眼睑开放眼区角膜上皮异常增厚,Krt12表达异常且Krt14表达水平明显升高,而MycnV406A/+E16.5眼睑闭合眼区无异常,推测胚胎期眼睑闭合延迟可能影响角膜上皮细胞分化。3、Mycn V406A突变影响角膜上皮细胞分化的机制的初步分析筛选出6-8 W出生后眼睑开放型与闭合型角膜混浊小鼠,设同窝野生型小鼠对照。采用免疫组织化学技术对小鼠角膜上皮细胞周期蛋白D1(cyc1in D1)、整合素β 1(Integrin β1)、整合素β4(Integrin β4)、E-钙粘素(E-cadherin)进行检测。结果发现:(1)野生型小鼠角膜上皮整合素β1、β4阳性细胞主要局限于基底层且整合素β1呈弱阳性;眼睑开放型小鼠角膜上皮细胞整合素β1、β4均呈强阳性且角膜上皮增厚区呈阴性;眼睑闭合型小鼠角膜上皮所有细胞整合素β1、β4呈强阳性。(2)与野生型小鼠相比,眼睑开放型和闭合型小鼠角膜上皮细胞周期蛋白D1阳性细胞减少。(3)除开放型小鼠角膜表层细胞组化结果为阴性外,三组小鼠角膜上皮E-钙粘素免疫组织化学均呈阳性且无明显差异。研究显示:在前期获得一例角膜混浊小鼠并确定其由Mycn基因突变引起,在此基础上进一步发现角膜混浊可分为出生后眼睑开放型和闭合型两种并对突变小鼠进行遗传实验、角膜上皮组织学分析,从而了解MycnV406A突变引起小鼠角膜病变特点;免疫组织化学结果发现突变小鼠角膜上皮细胞分化异常,该异常可能与整合素β1、整合素β4、细胞周期蛋白D1表达异常有关。
【图文】：

１．２．１逦ＭＡＸ／ＭＬＸ蛋白网络逡逑ＭＹＣ蛋白家族及其相关的蛋白网络在调节细胞生长、分化和营养代谢等多个过程中逡逑发挥着重要作用［ＩＣＭ４１邋（图１）。ＭＹＣＮ蛋白是ＭＹＣ／ＭＡＸ蛋白网络的一部分，，该蛋白网络逡逑由几个邋ｂＨＬＨＺｉｐ邋调控因子、ＭＹＣ邋家族（ｃ－ＭＹＣ，ＭＹＣＮ，邋ＭＹＣＬ）、ＭＸＤ邋家族（ＭＸＤ１，逡逑ＭＸＤ２，邋ＭＸＤ３，邋ＭＸＤ４）、ＭＡＸ网络转录抑制因子（ＭＮＴ）和ＭＡＸ相关基因（ＭＧＡ）逡逑组成［１５＿１９］。ＭＹＣ和ＭＡＸ的异二聚体与Ｅ－ｂｏｘ序列ＣＡＣＧＴＧ结合［２（）’２１］，募集组蛋白乙酰逡逑转移酶（ＨＡＴｓ）和Ｔａｔ作用蛋白６０ｋＤａ基因（ＴＩＰ６０）使染色质保持开放结构［２２＿２５］。所有逡逑ＭＹＣ家族同源基因和ｂＨＬＨＺｉｐ家族成员都与ＭＡＸ结合，每个复合物都有一组独特的目逡逑的基因［２６，２７］。已知ＭＹＣ蛋白在结合前不活跃，所以ＭＹＣ／ＭＡＸ异二聚体对ＭＹＣ的功能逡逑至关重要［２８］。ＭＹＣ／ＭＡＸ异二聚体化通过募集ＨＡＴｓ促进增殖，而ＭＸＤ／ＭＡＸ依据ＨＤＡＣ逡逑活性抑制转录。有趣的是，ＭＸＤ的过表达可抑制ＭＹＣ的

使用蛛ｃ？－２５１引物对脚小鼠后代ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，再经Ｈｈａ邋Ｉ内切酶酶逡逑切。由于小鼠一条ＤＮＡ链由于Ｔ转变为Ｃ，邋ＧＴＧＣ转变为ＧＣＧＣ而被切开，逡逑野生型小鼠则不可切。以图１．１中样品为例可以看出ＰＣＲ产物大小约为２５１ｂｐ。逡逑Ｍｌ邋２３４５６７８逡逑５００ｂｐ逡逑ｌＯＯｈｐ邋Ｉ逦＾ｆｒ＇＇逦＇ｒ；逡逑图１．１ＭＪ；Ｃ？＿Ｘ／＋小鼠酶切分型结果逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｆｙｃ？（撒■丨＂ｍｉｃｅ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２、３、５、６、８：野生型小鼠；４、７：逦小鼠逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｋ邋２＞邋３＞邋５＞邋６，邋８：邋Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ邋ｍｉｃｅ；邋４＞邋７：邋ＭｙｃｒｔＶ４０６Ａ／＋ｍｉｃｅ逡逑２．２逦小鼠遗传实验结果逡逑将Ｂ６背景柳角膜混浊小鼠与野生型Ｂ６小鼠配种，并对后代小鼠进行观察筛逡逑选。遗传结果统计显示：在６６只后代小鼠中，有３１只小鼠基因型为柳ｃ／／ｎ，其中２０逡逑只小鼠确定为角膜混浊（其中部分小鼠伴有小眼表型）（角膜混浊外显率为６４．５邋％）邋，邋４逡逑只为严重小眼（由于眼球过小无法暴露，故不能确定是否同时伴有角膜混浊），７只为正逡逑常表型。在２０只确定为角膜混浊小鼠中，９只小鼠为初生时（Ｐ０）眼睑开放小鼠并且该小逡逑鼠角膜混浊程度严重，故将角膜混浊小鼠分为出生后眼睑开放型角膜混浊小鼠（图１．２邋Ｃ）逡逑及出生后眼睑闭合型角膜混浊小鼠（图１．２邋Ｄ）（由于小鼠从Ｐ０－Ｐ１４具有一定死亡率
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R772.2;R-332

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 董岿然;高解春;陈莲;杨毅;;化疗对神经母细胞瘤MYCN基因表达及其影响[J];中华小儿外科杂志;1997年05期

2 冯晨;唐锁勤;王建文;刘立真;高晓宁;龙卉;;荧光定量RT-PCR检测神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA的表达[J];中国当代儿科杂志;2007年01期

3 钟敏;沈莉菁;陈芳源;张勇;匡颖;钟华;钟济华;;MYCN转基因斑马鱼对造血调控因子的影响[J];诊断学理论与实践;2011年02期

4 苗欢欢;李佩玲;;MYCN和mi RNAs在神经母细胞瘤中的研究进展[J];中国优生与遗传杂志;2015年04期

5 雷冬梅;刘宝俊;张威;王宏伟;楚天骄;;MYCN和OCT4在小儿神经母细胞瘤组织中的表达及意义[J];中国妇幼保健;2015年20期

6 胡惠丽,何乐健;神经母细胞瘤MYCN基因扩增和CD44的表达[J];中华病理学杂志;2004年04期

7 吕凡;邬文杰;张弛;吴晔明;;MYCN基因表达变化增强神经母细胞瘤细胞SK-N-BE(2)凋亡[J];中国肿瘤临床;2012年15期

8 冯晨;唐锁勤;王建文;龙卉;杨光;;苦参碱抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞增殖及MYCN基因mRNA的表达[J];中国当代儿科杂志;2008年02期

9 冯晨;唐锁勤;张晓飞;王建文;龙卉;高晓宁;;RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因的初步研究[J];临床儿科杂志;2006年02期

10 花紫菱;沈莉菁;李丽玮;李志强;;MYCN转基因型斑马鱼系岩藻糖转移酶基因谱表达的研究[J];临床输血与检验;2014年03期

相关会议论文 前9条

1 冯晨;唐锁勤;王建文;高晓宁;龙卉;杨光;;荧光定量RT-PCR方法检测神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA的表达[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

2 冯晨;唐锁勤;张晓飞;王建文;龙卉;高小宁;;RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因的初步研究[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

3 郝良纯;;MYCN基因表达增强对于神经母细胞瘤细胞MDM2-p53通路及药物敏感性的影响[A];第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议论文汇编[C];2014年

4 王晶;顾松;徐敏;;通过敲除PERK加强GANT-61对MYCN扩增性神经母细胞瘤细胞系的抑制作用的研究[A];第九届中国肿瘤学术大会暨第十五届海峡两岸肿瘤学术大会论文集[C];2016年

5 吕凡;施诚仁;;MYCN基因表达抑制诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡[A];第八届全国儿童肿瘤学术会议论文汇编[C];2009年

6 崔红娟;;Phox2B在MycN转基因小鼠的神经母细胞瘤肿瘤发生的作用机制[A];2010’全国肿瘤分子标志及应用学术研讨会暨第五届中国中青年肿瘤专家论坛论文汇编[C];2010年

7 吕凡;张弛;严文波;邬文杰;施诚仁;;MYCN基因表达增强促进神经母细胞瘤SK-N-SH细胞化疗敏感性[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年

8 冯晨;唐锁勤;王建文;龙卉;高小宁;杨光;;以叶酸受体为靶向的脂质体介导MYCN基因小干扰RNA抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞的增殖[A];中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会论文汇编（上册）[C];2008年

9 沈莉菁;陈芳源;钟敏;张勇;匡颖;林文洁;钟华;钟济华;;MYCN基因对造血转录因子的调控[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年

相关博士学位论文 前3条

1 田培超;靶向MYCN干扰稳转株的构建及联合TAE684对神经母细胞瘤生物学行为的影响[D];郑州大学;2014年

2 任平;谷氨酰胺转运体ASCT2在MYCN扩增的神经母细胞瘤中的生物学功能及分子调控机制研究[D];华中科技大学;2014年

3 赵翔;转录因子CTCF与长链非编码RNA MYCNOS协同促进神经母细胞瘤中MYCN表达的机制研究[D];华中科技大学;2016年

相关硕士学位论文 前9条

1 漆重阳;Mycn突变角膜混浊小鼠角膜病变特点及机制的研究[D];扬州大学;2019年

2 陈瑞;Mycn基因敲除引起小鼠角膜混浊及其机制的初步研究[D];扬州大学;2019年

3 于凡;抑癌基因RUNX3在神经母细胞瘤中对癌基因MYCN的调控作用研究[D];河北医科大学;2011年

4 蔡正菊;以叶酸受体为靶向的脂质体介导MYCN siRNA体内抑制神经母细胞瘤MYCN基因表达的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2007年

5 冯晨;MYCN小干扰RNA抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年

6 刘强;鸡LIF/LIFR和MYCN基因组织表达及其遗传多态性对免疫性状的影响[D];吉林农业大学;2014年

7 彭智勇;9-顺式维甲酸联合细胞毒药物对MycN扩增型神经母细胞瘤细胞毒性及MycN、MDR1表达的影响[D];南方医科大学;2013年

8 刘文;MYCN与MINA调控神经母细胞瘤细胞增殖和成瘤及其相互作用的研究[D];西南大学;2017年

9 尹华;三氧化二砷对LA-N-5细胞MYCNmRNA表达及细胞侵袭性的影响[D];中国人民解放军军医进修学院;2009年

本文编号：2662712