改良CLARITY技术及其在肝脏组织结构学的应用研究

发布时间：2020-05-14 07:49

【摘要】：目的:比较4种不同浓度水凝胶在鼠脑、肝、肾组织中的应用,探索各种组织透明化过程中水凝胶浓度的最优比,其次为优化改良CLARITY肝脏组织水凝胶固定透明化技术,基于该技术对肝癌模型鼠三维结构的应用研究。方法:1、按照原始水凝胶中丙烯酰胺(A)、甲叉双丙烯酰胺(B)、多聚甲醛(P)的终浓度比,制备A4B4P4(A:B:P=4%:0.05%:4%)、A2B2P4(A:B:P=2%:0.025%:4%)、A1B1P4(A:B:P=1%:0.0125%:4%)、A4B4P0(A:B:P=4%:0.05%:0)水凝胶。选取8只昆明小鼠随机分为4组,每组2只,分别采用A4B4P4、A4B4P0、A2B2P4、A1B1P4水凝胶进行灌注,然后行组织固定及透明化处理。计算经4种水凝胶处理后小鼠脑、肝、肾组织的相对透明度及蛋白损失量,同时对脑、肝、肾组织进行免疫荧光标记,完成三维重建。2、利用双相水凝胶进行肝组织固定,将固定好的组织切成1mm厚的切片,随机分为两组,SDS组和SDS+脂肪酶组,SDS组采用十二烷基硫酸钠SDS清除液进行被动脂质清除9天,SDS+脂肪酶组先采用SDS清除液被动脂质清除5天,随后浸泡于脂肪酶溶液中4天,两组均进行透明灰度值测定,并给予细胞核DAPI染色检测标记深度。3、选取25只SD大鼠,随机分为对照组和造模组,造模组进行18周腹腔注射二乙基亚硝胺DEN,对照组进行18周腹腔注射生理盐水。分别将对照组和造模组肝脏组织进行苏木素-伊红染色,同时分别对两组肝脏组织进行透明化,同时然后进行免疫荧光标记,完成三维重建,并测量管腔平均面积。结果:1、A2B2P4组、A1B1P4组小鼠脑组织相对透明度均高于A4B4P4、A4B4P0组(均P0.05);A1B1P4组小鼠肝组织的相对透明度高于其他3组(均P0.05);A2B2P4、A1B1P4组小鼠肾组织的相对透明度均高于A4B4P4、A4B4P0组(均P0.05)。A4B4P0组小鼠脑、肝、肾组织蛋白损失量均大于其他3组(均P0.05);A2B2P4组小鼠肝、肾组织蛋白损失量均低于A1B1P4组(均P0.05)。2、被动脂质清除过程中,第1天至第5天肝组织薄片的透明灰度值逐渐提升,但之后肝组织片清除速度缓慢,在第10天的清除仍然是不透明的;在第7、第9天,两组相对透明灰度值比较,差异有统计学意义(P0.01);SDS+脂肪酶组DAPI染色深度达115um,而SDS组DAPI染色深度达60um,SDS+脂肪酶组DAPI渗透深度是SDS组的1.92倍。3、成功建造大鼠肝癌模型,病理诊断为肝癌组织结构,利用组织透明化技术,完成对照组和造模组免疫荧光标记,对照组小叶间动、静脉平均面积均低于肝癌组平均面积(P0.001)。结论:通过比较4种不同浓度水凝胶在鼠脑、肝、肾组织中的应用,发现A2B2P4、A1B1P4水凝胶在脑组织透明化中的应用效果较佳,A1B1P4、A2B2P4水凝胶分别在肝组织、肾组织透明化中的应用效果最佳。通过优化CLARITY技术,发现双相水凝胶组织固定联合脂肪酶浸泡脂质被动清除技术可以快速实现鼠肝组织透明化。基于肝癌模型鼠,利用改良CLARITY技术对肝癌组织进行三维结构重建,实现了研究组织三维结构中空间位置关系分布,为CLARITY技术在肝脏组织病理学研究作出推动作用。
【图文】：

图 1-1 4 种不同浓度配比水凝胶透明鼠脑（a）、肝（b）、肾（c）组织效果图Fig.1-1 Four different concentrations of hydrogel transparent mouse brain (a), liver (b), kidney (c) tissue3.2 4 种浓度的水凝胶处理小鼠脑、肝、肾组织的相对透明度为了对透明度进行量化，我们利用凝胶成像仪测定透明组织灰度值，同时引入相对透明度概念，即清除后与清除前的灰度值比值。通过改变水凝胶浓度配比，从而研究组织清除过程中对清除效率所产生的影响。我们发现（1）经A4B4P4、A4B4P0处理后的脑组织的相对透明度均低于A2B2P4A1B1P4 组（均 P＜0.05）。（2）经 A4B4P4 处理后的肝组织的相对透明度均低于 A4B4P0、A1B1P4 组（均 P＜0.05），经 A4B4P0 处理后的肝组织的相对透明度仅低于 A1B1P4 组（均 P＜0.05）；经 A2B2P4 处理后的肝组织的相对透明度均低于 A4B4P0、A1B1P4 组（均 P＜0.05）。（3）经 A4B4P4、

RITY 技术及其在肝脏组织结构学的应用研究 硕士表 1-1 不同浓度水凝胶处理后脑 、肝、肾组织的相对透明度比较（x±s）-1 Comparison of relative transparency of brain, liver and kidney tissues after hydrogel with different concentrations (x±s)胶 N 脑组织 肝组织 肾组织4P4 4 8.03±0.16 3.27±0.16 5.60±0.184P0 4 8.25±0.15 4.35±0.24*4.36±0.252P4 4 8.69±0.13*#3.61±0.18#6.68±0.20*#1P4 4 8.93±0.21*#5.15±0.20*#ε6.91±0.18*#值 23 .927 57.432 59.044值 <0.001 <0.001 <0.001与 A4B4P4 比较，* P<0.05；与 A4B4P0 比较，#P<0.05；与 A2B2P4 比较，，εP<0.pared with A4B4P4 group, *p＜0.05. compared with A4B4P0 group, #p＜0.05. compareA4B4P0 group,εp＜0.05.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.7;R-332

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