microRNA-223-3p通过抑制LIF的表达和胞饮突的形成调控胚胎植入的机制研究
发布时间：2020-05-18 15:19
【摘要】：第一部分microRNA-223-3p和LIF在人类子宫内膜组织中表达水平的检测目的：检测内分泌功能正常、月经周期规则的女性的增生期、分泌中期子宫内膜组织中的microRNA-223-3p (miRNA223)和LIF的表达情况,探索miRNA223和LIF是否参与对胚胎植入的调控。方法：采用Real-time PCR (RT-PCR)的方法检测增生期、分泌中期的人类子宫内膜组织中miRNA223和LIF mRNA的表达情况。采用免疫组化(IHC)的方法检测增生期、分泌中期的人类子宫内膜组织中LIF蛋白的表达情况和细胞定位。结果：RT-PCR的结果显示,miRNA223在增生期子宫内膜组织中的表达水平显著高于分泌中期,而LIF mRNA在增生期子宫内膜组织中的表达水平显著低于分泌中期;IHC的结果显示,LIF蛋白在分泌中期子宫内膜组织中的表达水平显著高于增生期。LIF蛋白在分泌中期子宫内膜的腔、腺上皮细胞中高度表达,在基质细胞中亦有表达。结论：miRNA223和LIF在人类子宫内膜组织中的表达存在一定的时间、空间依赖性规律,该结果提示miRNA223和LIF可能参与对胚胎植入的调控,在胚胎植入过程中发挥重要作用。miRNA223和LIF的表达水平存在一定的负性相关性,该结果提示miRNA223和LIF在围着床期可能存在相互作用关系。以上结果尚需动物实验、细胞实验进一步验证。第二部分microRNA-223-3p通过调节LIF的表达和胞饮突的形成抑制小鼠胚胎植入目的：检测孕、非孕小鼠子宫内膜组织中miRNA223、LIF的表达情况。探索miRNA223是否通过抑制LIF的表达和胞饮突的形成进而影响胚胎植入。方法：采用RT-PCR的方法对孕、非孕小鼠子宫内膜组织中miRNA223、LIF mRNA的表达进行检测。采用Western Blot的方法对孕、非孕小鼠子宫内膜组织中的LIF蛋白进行检测。孕第3天上午使用miRNA223激动剂(miRNA223-Agomir)对孕小鼠进行单侧宫角注射,孕第4天下午牺牲小鼠,采用RT-PCR的方法检测miRNA223、LIF mRNA的表达情况：采用IHC的方法检测LIF、VEGF、CD34蛋白的表达情况：采用透射电镜的方法检测小鼠子宫内膜胞饮突的形成情况。孕第9天上午牺牲小鼠,解剖并进行植入胚胎计数。结果：孕小鼠子宫内膜组织中的miRNA223表达水平显著低于非孕小鼠,而LIF mRNA及蛋白的表达水平显著高于非孕小鼠。宫角注射miRNA223-Agomir后,注射侧的miRNA223表达水平显著高于注射对侧,而注射侧LIF蛋白的表达水平显著低于注射对侧。电镜结果显示,注射侧的小鼠子宫内膜中胞饮突形成显著受损。注射侧植入胚胎数显著低于注射对侧。结论：小鼠子宫内膜组织中miRNA223、LIF的表达规律与人类类似。miRNA223可以抑制胚胎植入,该效应可能是通过下调LIF蛋白的表达水平和阻碍胞饮突的形成而实现的。miRNA223是否直接作用于LIF并发挥生物学作用,LIF具体通过何种机制影响胞饮突,尚需进一步的研究。第三部分microRNA223-3p通过直接抑制LIF的表达干扰子宫内膜上皮细胞骨架目的：验证miRNA223对LIF的调控作用是否属于直接作用；胞饮突是围着床期子宫内膜腔上皮细胞发生形变的产物,探索miRNA223是否通过下调LIF蛋白的表达水平影响子宫内膜上皮细胞的细胞骨架而损害胞饮突的形成。方法：使用miRNA223过表达克隆和LIF3' UTR端靶标克隆转染293T细胞并进行荧光素酶检测。使用miRNA223前体克隆对体外培养的子宫内膜上皮细胞来源的HES、RL95-2细胞系进行过表达干预,采用细胞免疫荧光化学(ICC)的方法检测鬼笔环肽和β-Tublin以观察子宫内膜上皮细胞骨架的情况。结果：荧光素酶结果显示,miRNA223与LIF之间的作用属于直接作用关系。经miRNA223前体克隆过表达干预后,miRNA223的表达水平显著升高,而LIF蛋白的表达水平显著下降。过表达干预后的HES、RL95-2细胞均表现出不同程度的细胞骨架受损,其中HES细胞的鬼笔环肽和β-Tublin表达水平均降低；而RL95-2细胞的鬼笔环肽表达水平下降,但是β-Tublin无显著变化。结论：miRNA223可以直接作用于LIF并抑制LIF蛋白的表达,进而使子宫内膜上皮细胞骨架受损。miRNA223通过LIF干扰子宫内膜上皮细胞的细胞骨架,可能是导致子宫内膜上皮细胞胞饮突形成受损的原因。
【图文】：
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本文编号：2669923
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