基于自组装光交联多肽探针和生物质谱鉴定组蛋白修饰结合蛋白的研究

发布时间：2020-05-18 17:41

【摘要】：组蛋白翻译后修饰是表观遗传学的重要组成部分,参与调控基因转录,决定细胞命运,其异常表达往往与人类许多重大疾病的发生、发展密切相关。目前普遍认为,组蛋白修饰发挥功能的重要途径之一是通过招募特异性结合蛋白,进而调控下游的生物学活动,因此组蛋白修饰结合蛋白的鉴定对了解其表观遗传调控有着重要的生物学意义。然而,由于组蛋白修饰是动态变化的、修饰结合蛋白的丰度通常很低、修饰与其结合蛋白间的相互作用力弱且通常是瞬时的,因此人们对组蛋白修饰结合蛋白的了解远远滞后于修饰的研究,这在一定程度上阻碍了人们对修饰,尤其是新修饰的深入认识。本文构建了一种自组装光亲和多肽探针,该探针通过自组装技术同时将多肽和光交联基团连接到纳米金上,以多肽为诱饵,通过光交联反应将弱的非共价作用转化为稳定的共价键,提高结合蛋白的捕获。同时,光交联基团二苯甲酮和纳米金之间以聚乙二醇连接,通过对聚乙二醇长度和量的优化使光交联基团处于更优的空间位置,可以达到更优的光交联效果。在此基础上,我们将探针富集与蛋白质组学方法相结合,用带有修饰的多肽饰探针和不带修饰的多肽探针(对照)分别从核蛋白中富集结合蛋白,通过定量蛋白质组学技术将修饰的特异性结合蛋白从背景蛋白中分辨出来。我们将该方法首先运用到已知结合蛋白相对较多H3K4me3上,富集到了一些H3K4me3已知的直接和间接结合蛋白,验证了该方法的可行性。组蛋白赖氨酸β-羟基丁酰化(β-hydroxybutyrylation,bhb)、2-羟基异丁酰化(2-hydroxyisobutyrylation,hib)以及巴豆酰化(crotonylation,cr)都是近几年发现的新的赖氨酸修饰形式,其中赖氨酸β-羟基丁酰化发现最晚,该修饰不改变赖氨酸的电性,所以它很可能主要通过招募结合蛋白发挥功能,且其结合蛋白目前未见报道。因此我们将上述发展的方法应用到了H3K9bhb上,通过探针富集和质谱定量,结合相关生物学功能,发现了H3K9bhb的潜在结合蛋白ENL,通过PRM和western blot验证了定量结果的准确性,并通过计算机模拟分子对接实验解释了ENL识别K9bhb的结构基础。我们也将该方法应用到了H3K9hib及H3K9cr上,富集到了已知的结合蛋白的以及未报道的潜在结合蛋白,并借助生物信息学工具对这些结合蛋白进行了分子功能、细胞组分、生物过程的分析。由于这三种修饰在结构上具有一定的相似性,我们对这三种探针富集到结合蛋白的异同进行了比较。实验结果表明,我们的自组装光亲和多肽探针富集,结合基于质谱的定量蛋白质组学方法在研究组蛋白修饰与其结合蛋白的相互作用方面有着重要的应用潜力。
【图文】：

证新方法的可行性。为了找到 H3K4me3 的结合蛋白，研究者基于蛋白 INPHD结构域与H3K4me3多肽复合物形成的晶体结构设计了多肽探针（探针 1）。根据晶体结构可以发现，多肽与蛋白之间的相互作用主要涉及多肽的个氨基酸残基（即 ARTKme3QT），因此光交联基团二苯甲酮被置于第 7 个酸丙氨酸上，该位点位于介导相互作用的位点附近，而且不干扰修饰与蛋之间的相互作用。此外，还在多肽的碳端引入了炔基，炔基可以通过生物反应结合上荧光标签（如罗丹明）或亲和标签（如生物素），这两种标签分以用于实现蛋白的可视化或对蛋白进行纯化。实验验证结果表明，探针 1 在单一蛋白质水平或从复杂蛋白体系人细胞裂解液中标记几种已知的重组源 H3K4me3 结合蛋白，如 ING2，BPTF 和 JMJD2A。此外，这种基于光交方法也可用于寻找其他组蛋白修饰的结合蛋白。例如，已知的人 H3K9me3蛋白 HP1 就可以被基于 H3K9me3 的光亲和探针（探针 2，图 1）选择性捕5]。同样的探针也能从裂殖酵母的细胞裂解液中特异性的标记人 HP1 蛋白的蛋白 Swi6，这表明这种化学方法也可以用于分析遗传相对简单的模式生物修饰依赖性蛋白-蛋白相互作用。

一种化学蛋白质组学方法，该方法将光交联策略与 SILAC 技术相结合，称为CLASPI（交联辅助和 SILAC 为基础的蛋白鉴定，如图 2）。将 CLASPI 方法应用于分析 H3K4me3 结合蛋白中，将探针 1 和无修饰的对照探针（探针 C，图 1）分别与“轻”细胞全蛋白（细胞生长在含有天然同位素丰度形式的培养基中）和“重”细胞全蛋白（培养细胞所用培养基中精氨酸和赖氨酸上的碳和氮分别被13C 和15N 取代）孵育。在光交联后，将“轻”和“重”蛋白裂解液混合并通过 CuAAC 反应在多肽探针上连接上生物素，用于纯化捕获到的蛋白质，，通过SDS-PAGE 分离并用胰蛋白酶消化后，用 HPLC-MS / MS 分析所得多肽。“轻比重”（L / H）比值较高的蛋白被认为是 H3K4me3 的特异性结合蛋白。通过使用该方法，研究者从人 HeLa 细胞裂解液中鉴定了许多已知的 H3K4me3 结合蛋白，更重要的是，还发现了几种之前未被报道的 H3K4me3 结合蛋白，包括 MORC3和 SPIN1，并通过体外等温热量滴定试验进一步验证了这些蛋白与 H3K4me3 修饰之间存在相互作用。随后，有研究者揭示了 SPIN1 与组蛋白 H3K4me3 的结合与 Wnt 信号激活相关[28]。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R346

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本文编号：2670086