巨核细胞的体外大规模生产及临床前安全性和有效性研究
发布时间：2020-05-20 00:11
【摘要】：目的:血小板输注是临床上提升患者血小板数目、阻止大量出血的最主要的治疗手段。目前,仅靠志愿者捐献的血小板已经无法满足临床上血小板需求量的持续增加。利用干细胞体外诱导分化产生的巨核细胞有望成为捐献来源血小板的替代产品应用于临床,以缓解血小板资源紧张的现状。本课题提出建立一个高效率、大规模生产巨核细胞的平台,获得大量安全有效的巨核细胞供临床患者使用。方法:1.建立CD34+造血干/祖细胞体外高产量、高纯度产生巨核细胞的培养体系。分离脐带血CD34+细胞,通过比较包含不同细胞因子、生长因子和小分子化合物的因子组合刺激CD34+细胞扩增以及定向巨核系分化的效果,确定最佳的因子组合并优化培养时长以实现巨核细胞的体外高效生产。2.实现巨核细胞的大规模生产并对获得的巨核细胞进行特性鉴定。利用2L容积的滚瓶结合旋转培养系统建立巨核细胞中试生产平台。培养末期,利用瑞氏吉姆萨染色对巨核细胞的形态和结构进行鉴定;细胞免疫荧光染色分析细胞特异性标志物的表达情况;碘化吡啶染色结合流式细胞仪检测巨核细胞的多倍体含量;实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测巨核细胞分化相关转录因子基因的表达水平。3.在小鼠和非人灵长类动物模型中评价巨核细胞的体内安全性和有效性。利用非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型,评价人巨核祖细胞和成熟巨核细胞的体内代谢动力学以及血小板释放能力。动员食蟹猴外周血CD34+细胞并运用建立的培养体系产生食蟹猴巨核祖细胞和成熟巨核细胞,通过注射化疗药物卡铂建立食蟹猴骨髓抑制性血小板减少症模型,并进行巨核祖细胞以及成熟巨核细胞的移植,评价其体内安全性及提升血小板数目的有效性。结果:1.经过多轮筛选及优化,获得了促进CD34+细胞扩增以及巨核系定向分化的最佳因子组合,建立了无血清、无基质成分、不涉及基因操作的“二步法”培养体系,实现了巨核细胞的高产量、高纯度生产。1个脐带血CD34+细胞通过该培养体系体外培养6+7天,可以产生约1.0×104个巨核系细胞(CD41a+和CD42b+细胞的纯度分别为82.4%± 6.1%和73.3%± 8.5%),比之前文献报道的巨核细胞产量高30～650 倍。2.利用滚瓶旋转体系建立的中试生产平台实现了巨核细胞的标准化、规模化生产,并且进一步提高巨核细胞的产量约2倍。形态学研究显示,培养获得的成熟巨核细胞胞体巨大,平均直径达到29.1 ±4.6 μm,并且有明显的前血小板丝状结构出现。DNA多倍体含量检测表明,获得的巨核细胞中4倍体占19.63%±1.81%,8倍体占11.13%±1.52%,16倍体及以上占4.00%±0.54%。RT-qPCR研究显示,诱导分化末期GATA-1、FOG-1、NF-E2 以及β-tubulin mRNA的表达水平显著增加,在分子水平上证明了巨核细胞的分化和成熟。3.在NOD/SCID小鼠模型中,移植的人巨核祖细胞能够归巢到骨髓并持续产生血小板;移植的成熟巨核细胞大部分在小鼠肺部截留,0.5～3小时(h)荧光信号最强,同时可在小鼠外周血中检测到人源血小板,于6～8h达到峰值,随后逐渐下降。在食蟹猴骨髓抑制性血小板减少症模型中,自体移植巨核祖细胞能够提升血小板计数最低值并且促进造血系统的恢复;自体或同种异体移植成熟巨核细胞3h后可以在食蟹猴外周血中检测到功能性血小板的产生,持续48h。此外,实验进行及完成后12个月的观察期显示,所有动物健康状况良好,无任何异常及肿瘤的形成,证实“二步法”培养体系产生的巨核细胞具有长期的体内安全性。结论:本研究提出的“二步法”培养体系和中试规模生产平台能够在体外高产量、高效率地诱导造血干细胞产生功能性巨核细胞,为临床上血小板减少症的治疗提供了新思路。
【图文】：
组合ＳＦＴ３邋（ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ－３）促进人脐带血造血干／祖细胞体外扩增及ＣＤ３４逡逑阳性率保持的效果。初始接种细胞数量为４ｘｌ0４，ＣＤ３４＋细胞阳性率为９４．２％±３．５°／0。逡逑结果如图１所示，在培养的前三天，各组细胞X椫车乃俣榷急冉匣郝谴拥冢冲义咸炜迹赴┰龀拭飨缘纳仙魇啤Ｆ渲校蜃幼楹希樱疲裕澈停樱疲裕常蹋模檀傧赴义显鲋车男Ч嗨疲谂嘌冢短炝阶榈淖芟赴糠直鹞保担欤埃，
本文编号：2671697
【图文】：
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