具有修复抗生素导致肠道生态失调功能的乳杆菌筛选及其机制研究

发布时间：2020-05-20 17:27

【摘要】：肠道微生物是人体重要的“消化器官”,它和胃肠道相互影响密切并且具有共同进化的共生关系。抗生素大量应用于多种疾病的治疗,但同时也可能会导致肠道微生物群生态失调如关键菌群的缺失、致病菌增多、多样性降低和代谢机能改变等,进而引发肠道疾病的产生,如抗生素相关性腹泻、肠易激综合征、炎症性肠病和伪膜性肠炎等,甚至可能诱发相关代谢、免疫疾病如抗生素相关性肥胖、过敏、哮喘、糖尿病和风湿性关节炎等。已有研究表明,从发酵食品中分离的乳杆菌对肠道健康具有有益作用,并且对肠道的代谢和免疫具有调节功能。本研究使用常见抗生素的包括氨苄青霉素、头孢克肟和克林霉素以建立肠道菌群紊乱模型,并探究不同性质的乳杆菌对肠道菌群、代谢、肠道屏障和免疫的调节功能且深入探究其作用机理,为益生菌的功能性开发提供相应的科学依据。主要研究结果如下:首先通过给小鼠灌胃抗生素(氨苄青霉素、低剂量头孢克肟、高剂量头孢克肟、克林霉素)建立肠道菌群紊乱模型,基于小鼠肠道菌群16S rRNA基因测序表明4种抗生素暴露均导致小鼠微生物群落多样性以及菌群的组成、结构和相对丰度的改变,从而引发小鼠肠道生态和功能失调。利用热图分析和LEfSe算法分析得到氨苄青霉素导致的肠道菌群结构失调中显著改变的关键菌群特征,即相对丰度增加的克雷伯氏菌属(Klebsiella)、厌氧支原体属(Anaeroplasma)、肠球菌属(Enterococcus)和肠杆菌属(Enterobacter),以及相对丰度显著减少的毛螺菌科(Lachnospiraceae)和阿克曼氏菌属(Akkermansia)。采用非量测的多维变量统计(NMDS)得到宿主生理和肠道菌群之间的关联,可知氨苄青霉素导致的菌群失调与血清中内毒素和二胺氧化酶含量增加以及紧密连接蛋白ZO-1的表达下降相关,建立了模拟临床剂量抗生素导致的肠道生态失调的小鼠模型。其次,针对20株分离于发酵食品的乳杆菌进行筛选,得到包括鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌各5株。通过测定它们的生物学性质包括代时、胃肠液耐受能力、糖利用情况、耐药性、细胞粘附性和定植性等,发现乳杆菌的各个性质存在种间和株间差异。不同乳杆菌在模拟胃肠道环境中的耐受能力差异很大,其中,鼠李糖乳杆菌LGG、植物乳杆菌CCFM605和CGMCC12436以及干酪乳杆菌CCFM5和CGMCC12435在模拟胃液和肠液中存活率都相对较高。小鼠体内的定植能力测定中,鼠李糖乳杆菌CCFM492、植物乳杆菌中CCFM4、CCFM595和CGMCC12436以及干酪乳杆菌CCFM30的定植能力良好。综合各体外性质和体内定植进行主成分分析,并选取最接近主成分1和主成分2的菌株,形成两组具有不同优良生物特性的乳杆菌混菌组合,进行后续实验分析。其中乳杆菌混菌A组的菌株细胞粘附率和低聚糖利用性质优良,而乳杆菌混菌B组中的菌株具有相对较快的生长速率以及良好的定植性和模拟肠液耐受性。评价筛选的两组乳杆菌混菌对不同抗生素包括氨苄青霉素、头孢克肟和克林霉素导致肠道菌群紊乱的修复效果,发现乳杆菌混菌A组(包括鼠李糖乳杆菌LGG、植物乳杆菌CCFM4、干酪乳杆菌CCFM5和瑞士乳杆菌CCFM673)和B组(包括鼠李糖乳杆菌CCFM492、植物乳杆菌CGMCC12436、干酪乳杆菌CGMCC12435和瑞士乳杆菌CCFM6)均对氨苄青霉素和高剂量头孢克肟导致的肠道菌群门水平上结构和组成紊乱有恢复作用,但两组乳杆菌混菌对克林霉素导致的紊乱恢复效果不明显。两组乳杆菌混菌对氨苄青霉素和头孢克肟导致的盲肠内容物中短链脂肪酸降低均有显著恢复能力,可提高其含量至正常水平,但是两组乳杆菌混菌对克林霉素导致的短链脂肪酸水平降低的恢复效果较差。此外,乳杆菌混菌B组可以缓解高剂量头孢克肟引发的小鼠结肠和回肠的组织损伤和炎症至对照组水平,且可有效修复高剂量头孢克肟导致的包括Mucispirillum、肠球菌属(Enterococcus)、Alistipes和Turicibacter在内的特定菌群相对丰度的变化。进一步分析乳杆菌单菌株对氨苄青霉素诱导的肠道生态失调的菌群紊乱、代谢物改变和免疫炎症的缓解作用,发现所测8株乳杆菌(来自于乳杆菌混菌A组和B组)对肠道通透性和血清内毒素水平的恢复作用较为普遍。而其中3株菌:干酪乳杆菌CGMCC12435(LacC)、植物乳杆菌CGMCC12436(LacP)和鼠李糖乳杆菌LGG(LacG)可显著增加结肠或回肠中部分紧密连接蛋白如ZO-1、闭合蛋白Occludin和Claudin-1的相对表达量。进一步通过LEfSe分析表明,LacC、和LacP修复组的差异菌群数量比自然恢复组少,说明3个乳杆菌单菌组均对肠道菌群失调有显著修复作用。但在对粪便代谢物的修复效果上3株菌具有差异,仅LacC使粪便中乙酸、丙酸和丁酸的水平显著恢复到初始水平,并且更为有效的恢复了代谢物的整体结构组成。LacC治疗组中肠道菌群和代谢物的相关性分析表明升高的乙酸盐水平和肠道中柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、S24-7、理研菌科(Rikenellaceae)和梭菌科(Clostridiaceae)的相对丰度增加有正相关关系。此外,LacC菌株可有效调节氨苄青霉素导致的结肠组织中sIgA、RegⅢγ和IFN-γ的升高,LacG可降低造模组中sIgA和RegⅢγ水平的升高,而LacP对所测免疫因子无明显调节效果。最后,深入解析乳杆菌在代谢通路、肠道屏障和免疫调节等方面缓解抗生素导致生态失调的机制,结果表明LacC和LacP菌株可显著缓解氨苄青霉素使用后结肠内NF-κB水平的升高,并降低NF-κB p65的免疫荧光表达量,因此这2株菌可通过NF-κB信号通路调节结肠内氨苄青霉素导致的免疫炎症。在Caco-2细胞中通过Transwell构建肠道屏障体系,并使用LPS刺激以探究抗生素作用机制,结果表明乳杆菌LacC和LacP对LPS刺激导致的TEER值下降即肠道屏障破坏的保护效果不明显,但能够调节丁酸受体GPR109A的基因表达上调以激活Toll样受体4信号。根据全基因组分析推测了其中一株植物乳杆菌CGMCC12436的潜在功能性基因,发现其中参与编码荚膜多糖合成的cpsD基因簇,这可能与它良好的肠道适应性和功能活性有关。
【图文】：

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图 1-1 抗生素对肠道微生物、代谢、肠道屏障和免疫的影响Fig. 1-1 The impact of antibiotics on the microbiota, metabolites and immunity.2.4 抗生素使用导致的生态失调和肠道疾病近期研究表明抗生素的使用对肠道微生物和相关疾病有影响，健康人体服用抗生周或更少后，菌群多样性降低并且特定科或属消失，抗生素抗性基因上调，且这种持续 6 个月到 2 年[91]。抗生素还可能导致婴儿和成人的过敏和代谢综合征，有研究

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第二章抗生素导致的肠道功能失衡与评价模型建立2.4 结果与讨论2.4.1 不同抗生素对小鼠体重的影响如图 2-1 所示，在造模 14 天时，，氨苄青霉素组、高剂量头孢克肟组和克林霉素组中小鼠体重都显著低于对照组小鼠体重（P 值分别为 P<0.05，P<0.001，P<0.05）。而低剂量头孢克肟组在灌胃 12 天时体重显著降低（P<0.05），但 14 天时并无显著差异。其中，高剂量头孢组体重下降较为剧烈，在灌胃 4 天时已经显著下降（P<0.01）。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R37

【参考文献】