重组sTNFα-RI蛋白同义密码突变库构建、筛选及结构优化

发布时间：2017-03-25 13:10

  本文关键词：重组sTNFα-RI蛋白同义密码突变库构建、筛选及结构优化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肿瘤坏死因子-（TNF-）主要由单核-巨噬细胞产生，是介导类风湿性关节炎（RA）的一种重要炎症因子。可溶性肿瘤坏死因子-（sTNF）为膜肿瘤坏死因子-的水解产物，在体内以同源三聚体的活性形式存在。该细胞因子与滑膜细胞、巨噬细胞、软骨细胞和破骨细胞上的相关受体（TNF-R,主要为TNF-RI和TNF-RII）结合，使这些细胞活化，产生基质金属蛋白酶（MMPs）、胶原酶、基膜溶解酶等，导致局部炎症反应，进一步引发软骨破坏和骨侵蚀。近十年来以sTNF为靶标的生物药物发展迅猛，2013年全球单一产品销售额前10位的药物中，以sTNF为靶标的治疗类风湿性关节炎药物占有3位（Humira、Remicade、Enbrel），其中前两位是TNF-的抗体类药物，Enbrel为TNF-RII药物。随着这些药物的应用，临床发现长期给药容易引起感染和肿瘤。此外，上述药物采用哺乳动物细胞如CHO工程细胞表达，制备难度大，需要进行糖基化等表达后修饰，质量难以控制，且制造成本高，进口药物的平均售价2万/支，难以惠及广大患者，因此开发新型、高效、安全的类风湿性关节炎药物成为当前研发的焦点。 本研究以截短sTNF-RI重组蛋白（Sop55-2.6）为研究对象，以提高该蛋白包涵体产量及实现其可溶性表达为目标，从基因水平和蛋白水平对该分子展开结构设计与优化。论文涉及的主要内容包括：（1）采用同义密码突变库构建及筛选新技术，对目标蛋白的全基因密码进行优化，以提高该蛋白的包涵体产量。（2）应用计算机软件对该蛋白序列的构效关系进行分析，从分子截短、表达载体、融合标签应用、氨基酸突变及宿主方面展开设计与优化，以实现Sop55-2.6蛋白的可溶性表达。 在同义密码修饰研究方面，设计了同义密码库的简并引物，并对退火时间进行优化，构建了目标基因完整的同义密码突变库，库容达到1013；完成了445株克隆筛选，针对其中产量高于对照组的45株克隆进行测序，获得42株基因序列不同但氨基酸序列未发生变化的克隆菌株，其同义密码突变阳性率高达93%；进一步放大培养验证后，成功筛选出包涵体收率及目标蛋白相对百分含量明显高于对照株的同义突变菌株，其每升发酵液的目标蛋白总产量比对照株提高2.44倍。 在蛋白分子结构优化方面，首先通过截短技术，去除C-端19个氨基酸，设计了Sop55-2.0蛋白，采用pET22b（+）载体实现原核细胞周质腔可溶性表达，经过初步纯化分析发现，ELISA方法检测的EC50值约为337.4g/ml；其次采用pET32a（+）载体，，通过Trx标签蛋白与Sop55-2.0蛋白偶联实现了该蛋白的融合可溶性表达，通过纯化、EK酶酶切得到纯度大于85%的Sop55-2.0蛋白，ELISA检测其EC50值为154.6g/ml。为了进一步提高截短蛋白的抗原结合力和可溶性，在Sop55-2.0结构基础上，依据计算机分析切除N端17个氨基酸，获得Sop55-2domain蛋白，并将Sop55-2.0、Sop55-2domain与Sop55-2.6蛋白在CHO细胞中实现了Fc结合的二倍体形式的可溶性表达，均获得纯度大于95%目标蛋白，通过L929细胞学检测表明：Sop55-2.6-Fc蛋白的比活接近于Sop55-2.6的比活值，而Sop55-2domain-Fc和Sop55-2.0-Fc未显出明显生物活性，由此确定Sop55-2.6的蛋白结构为药物开发的基本形式。为了继续实现Sop55-2.6蛋白的可溶性表达，采用3×Flag融合标签，并将Sop55-2.6的氨基酸序列进行多点突变，实现了Sop55-2.6分子在细胞质内的可溶性表达，可溶性目标蛋白产量达到20%，ELISA初步检测该融合蛋白的EC50为4.4g/ml，有关该可溶性蛋白的细胞学功效需展开进一步的评价。 本研究采用同义密码库构建及筛选新技术，通过密码偏性优化筛选，提高目标蛋白的表达产量。另一方面通过计算机辅助的结构分析，从分子截短、表达载体、融合标签应用、氨基酸突变及宿主方面展开设计与优化，确定了Sop55-2.6序列作为药物研发的基本序列，并实现该蛋白在E.coli细胞中的可溶性表达，为本品的新药研发等提供了有力支持。课题采用的新技术和分子进化的思路也为重组蛋白结构设计与优化提供了有价值的参考。
【关键词】：重组sTNF-RI 同义密码突变库 分子进化 重组蛋白可溶性表达
【学位授予单位】：四川抗菌素工业研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 1 前言12-17
• 1.1 肿瘤坏死因子12
• 1.2 肿瘤坏死因子受体12-13
• 1.3 治疗类风湿性关节炎的药物13-16
• 1.3.1 非甾体抗炎药13-14
• 1.3.2 慢作用抗风湿药14
• 1.3.3 生物药物14-16
• 1.4 药物分子设计与优化的研究进展16
• 1.5 本论文的研究意义16-17
• 2 重组 sTNF -RI 蛋白同义密码突变库的构建与筛选17-31
• 2.1 引言17-18
• 2.2 实验试剂及材料18-19
• 2.2.1 质粒与细胞株18
• 2.2.2 主要试剂与耗材18
• 2.2.3 试剂配制18-19
• 2.2.4 主要实验仪器19
• 2.3 实验方法19-24
• 2.3.0 同义密码突变库模板19-20
• 2.3.1 同义密码突变库引物设计20-21
• 2.3.2 同义密码突变库的构建21-22
• 2.3.3 重组表达质粒的构建22
• 2.3.4 重组表达质粒的电击转化22-23
• 2.3.5 菌落 PCR 检测阳性单克隆23
• 2.3.6 阳性菌的诱导表达23
• 2.3.7 目标蛋白的 dot blot 分析23-24
• 2.3.8 同义突变菌的小试培养验证24
• 2.3.9 放大培养及蛋白产量验证24
• 2.4 结果与分析24-30
• 2.4.1 载体的准备24-25
• 2.4.2 同义密码突变库的装配25-26
• 2.4.3 同义密码突变库测序及库容计算26
• 2.4.4 同义密码突变库的酶切26-27
• 2.4.5 克隆菌落 PCR 鉴定27-28
• 2.4.6 Dot blotting 分析目标蛋白的表达结果28
• 2.4.7 同义突变菌株的测序结果28-29
• 2.4.8 克隆菌表达的小试验证29-30
• 2.4.9 蛋白产量的放大验证30
• 2.5 小结与讨论30-31
• 3 蛋白可溶性表达分子结构优化31-58
• 3.1 引言31-33
• 3.2 实验试剂及材料33-36
• 3.2.1 载体与细胞株33-34
• 3.2.2 主要试剂34-35
• 3.2.3 试剂配制35-36
• 3.2.4 主要实验仪器36
• 3.3 方法36-44
• 3.3.1 引物设计36-37
• 3.3.2 Sop55-2.0 基因序列的扩增37
• 3.3.3 Sop55-2.0 基因与载体的酶切与回收37-38
• 3.3.4 基因的连接与转化38-39
• 3.3.5 克隆菌落 PCR 鉴定39
• 3.3.6 阳性克隆菌的表达及样品准备39-40
• 3.3.7 Western Blot 检测40
• 3.3.8 蛋白样品纯化40-41
• 3.3.9 ELISA 检测亲和力活性41-42
• 3.3.10 CHO 细胞表达结构形式的构建42
• 3.3.11 基于 L929 细胞的的生物活性检测42-43
• 3.3.12 融合标签及氨基酸突变优化 Sop55-2.6 蛋白可溶性表达43-44
• 3.4 结果与分析44-57
• 3.4.1 原核表达载体及 Sop55-2.0 分子基因的准备44-45
• 3.4.2 克隆菌的菌落 PCR 验证45-46
• 3.4.3 WB 检测结果46-48
• 3.4.4 Sop55-2.0 蛋白纯化及检测48-50
• 3.4.5 ELISA 亲和力检测50-52
• 3.4.6 CHO 表达蛋白与原蛋白电泳结果对比52-54
• 3.4.7 生物活性测定结果54-55
• 3.4.8 融合标签及氨基酸突变优化结果55-57
• 3.5 小结与讨论57-58
• 4 结论与展望58-60
• 参考文献60-65
• 致谢65
• 作者在读期间科研成果简介65-66
• 综述：氨基酸同义密码子研究进展66-72
• 参考文献70-72

【参考文献】

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本文编号：267247