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酸敏感离子通道(ASIC1a)在M2型巨噬细胞极化中的作用研究

发布时间:2020-05-22 02:16
【摘要】:目的:ASIC1a(acid-sensitive ion channel 1a)是酸敏感离子通道家族成员,在外周和中枢神经系统中广泛表达,此外还发现在小鼠树突状细胞(DC)、巨噬细胞、肺动脉平滑肌细胞以及软骨细胞等均有表达,因其与多种疾病的发生与发展密切相关而具有重要生理学意义。巨噬细胞(macrophage)是天然免疫的重要组成部分,激活状态下分为M1型和M2型,在机体中对清除病原体、炎症及组织修复相关的初级免疫应答发挥重要作用。本课题组前期研究发现,巨噬细胞表达功能性ASIC1,ASIC1a敲除可上调M1型巨噬细胞膜分子CD80、CD86的表达,提示ASIC1a可能存在抑制M1型巨噬细胞的抗原提呈作用;ASIC1a在M2型巨噬细胞极化过程作用如何,并未有研究。本课题旨在研究ASIC1a在小鼠M2型骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMM)和M2型腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)极化过程中是否发挥作用,并进一步探讨ASIC1a影响M2型极化过程的机制。研究方法:取野生型(WT,Wild Type)与ASIC1a~(-/-)小鼠诱导培养BMM与PM,流式细胞术检测F4-80标记阳性巨噬细胞进行鉴定。IL-4刺激24h分别诱导M2型BMM与PM,RT-PCR检测M2型巨噬细胞标记物Arg1、FIZZ1、YM1、Mgl1和Mgl2 mRNA表达水平,免疫印记法(WB)检测M2型巨噬细胞标记蛋白Arg1及巨噬细胞ASIC1蛋白表达,流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面分子CD206与胞内分子FIZZ1表达。IL-4刺激BMM与PM不同时间点30min、60min、180min后,WB检测M2型巨噬细胞极化过程信号通路中STAT6磷酸化蛋白水平。实验所得数据用平均值±标准差表示,采用统计学软件GraphPad Prism 6进行双因素方差分析(Two way ANOVA),两两比较采用student's t检验,P㩳0.05时具有统计学意义。结果:流式细胞术检测BMM与PM细胞中F4-80标记的阳性巨噬细胞率分别约为96.6%和91.1%。一、IL-4刺激来源于WT与ASIC1a~(-/-)小鼠的BMM后:与WT相比,RT-PCR检测ASIC1a~(-/-)的M2型BMM标记物Arg1、FIZZ1、YM1、Mgl1和Mgl2 mRNA表达均出现不同程度的降低,WB检测Arg1蛋白表达明显下调;流式检测发现ASIC1a~(-/-)的M2型BMM表面分子CD206及胞内分子FIZZ1表达均明显下调。IL-4刺激WT与ASIC1a~(-/-)BMM不同时间点30min、60min、180min后,WB检测两组p-STAT6、STAT6表达水平之间无差异。二、IL-4刺激来源于WT与ASIC1a~(-/-)小鼠的组织巨噬细胞PM后:与WT相比,RT-PCR检测ASIC1a~(-/-)的M2型PM标记物Arg1、FIZZ1、YM1、Mgl1和Mgl2的mRNA表达也出现不同程度降低,WB检测Arg1蛋白表达下调;流式检测发现ASIC1a~(-/-)M2型PM表面分子CD206及胞内分子FIZZ1表达也均明显下调。IL-4刺激WT与ASIC1a~(-/-)的PM不同时间点30min、60min、180min后,WB检测p-STAT6、STAT6蛋白水平两组之间也无明显差异。结论:ASIC1a敲除引起M2型BMM与PM极化的下调,且此作用并非通过影响IL-4信号通路中的STAT6磷酸化下调M2型巨噬细胞的极化。
【图文】:

巨噬细胞,流式细胞术,模型构建,极化模型


态下巨噬细胞的吞噬作用以及表面膜分子的表达起到重要的作用;ASIC1a 敲除可上调 M1 型巨噬细胞膜分子 CD80、CD86 的表达,提示 ASIC1a 可能存在抑制M1 型巨噬细胞的抗原提呈作用。本课题主要研究 ASIC1a 敲除后,对于 M2 型巨噬细胞极化的影响及相关机制,从而全面论证 ASIC1a 在巨噬细胞中发挥的作用与功能。(一)ASIC1a-/-下调 M2 型骨髓来源的巨噬细胞(BMM)的极化1. 诱导 BMM 细胞向 M2 型极化模型构建流式细胞术鉴定 BMM 细胞,F4-80 标记的阳性率为 96.6%(图 1A)。IL-4刺激 BMM 获得 M2 型巨噬细胞:10ng/mL IL-4 刺激 BMM 12h、24h,Real-TimePCR 检测 M2 型巨噬细胞标记物 Arg1、FIZZ1、YM1 mRNA 表达均增加(图 1B),刺激 24h 后 Arg1 蛋白产生表达(图 1C)。上述实验结果提示:M2 型巨噬细胞极化模型构建成功。

杂合子,小鼠,逆转录,RT-PCR检测


华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文ASIC1a-/-下调 M2 型 BMM 的极化采用 WT 与 ASIC1a-/-小鼠来源的 BMM 进行实验,IL-4 诱导 BMM 细 型极化,研究 ASIC1a-/-对于 M2 型巨噬细胞极化过程的影响。 ASIC1a-/-小鼠基因鉴定、mRNA 及蛋白水平表达检测剪取小鼠耳朵组织以及取 BMM 细胞进行基因鉴定,结果如图 2A 所示310bp 位置的条带为 ASIC1a-/-,仅在 262bp 位置的条带为 WT,同时存在条带的则为 ASIC1a+/-(即杂合子)。利用 RT-PCR 技术对 WT 与 ASIC1a-BMM 细胞 ASIC1 进行 mRNA 表达检测,WB 对脑组织与 BMM 的 ASIC达进行检测,脑蛋白为阳性对照(图 2B,2C),结果显示: ASIC1a-/-M 细胞不表达 ASIC1 mRNA,不产生 ASIC1 蛋白。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R392

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本文编号:2675289

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