Nanodisc类膜体系中FGFR1c结构及活性的研究

发布时间：2020-05-22 14:49

【摘要】：成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是成纤维细胞生长因子(FGF)家族蛋白的受体蛋白。作为受体酪氨酸家族中的一员,FGFR在调控细胞的增殖、分化、迁移及细胞存活等过程中发挥着重要功能,FGFR信号通路的异常将导致多种疾病或者发育综合征的出现。FGFR位于细胞膜表面,其胞外端通过辅因子(肝素或klothos)结合配体,形成同源二聚复合体,引起胞内激酶区不同酪氨酸磷酸化位点发生反式磷酸化反应,进而活化下游的信号通路。FGFR胞内激酶结构域包含7个酪氨酸磷酸化位点,其中位于活化环上的Y653和Y654具有酪氨酸激酶活性;其他酪氨酸位点的磷酸化可以作为下游信号分子的结合位点,从而活化特定的信号通路。FGFR是单次跨膜的酪氨酸受体,然而体外研究中膜环境模拟的挑战性,限制了针对全长膜蛋白结构和功能的研究,导致绝大多数体外研究仍以局部结构域作为研究对象。因此寻找合适的类膜环境,对深入探究全长FGFR的结构和功能至关重要。在已知的多种类膜体系中,Nanodiscs是一种较为理想的体外类膜体系模型。Nanodiscs不仅含有双层的磷脂结构,而且可以依据不同的研究目的,通过调控磷脂的比例及组成,精确地调控nanodiscs尺寸的大小;同时组装后的复合物可以利用多种技术手段进行表征及分析。该技术已被尝试应用于多个膜蛋白的结构及功能研究中。本论文选择与肿瘤发生密切相关的一种成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族成员FGFR1 c,结合体外nanodiscs体系对其进行了一系列的探究。研究内容主要包括两部分:第一部分重点探究FGFR1c体外nanodiscs组装的适宜条件,并对FGFR1c的结构进行初步表征和功能验证;第二部分利用peptide nanodiscs体系研究局部膜环境对FGFR1c胞内激酶结构域活性的调控作用。取得的主要研究结果如下:1.构建了 FGFR1c的昆虫细胞表达体系,表达并纯化了全长FGFR1c蛋白,利用MSPΔH5 nanodiscs体系实现了针对全长FGFR1c及其配体复合物(bFGF/heparin/FGFR)的组装,并对FGFR1c进行生物冷冻电镜的初步结构表征和功能验证。2.利用peptide nanodiscs体系,通过调控磷脂与小肽的比例,实现了对nanodiscs尺寸的精确调控,并通过引入一定比例的DGS-NTA(Ni)磷脂将FGFR胞内激酶结构域(FGFR1K)锚定在类膜体系的表面,在类膜体系环境下对FGFR1K的活性进行了系统研究。
【图文】：

第一章ＦＧＦＲ结构域功能研宄进展及类膜体系在膜蛋白研宄中的应用白进行分类，分为很多蛋白亚家族。目前，较为一致的观点是将ＦＧＦ：５个旁分泌的亚家族，一个内分泌的亚家族（ＦＧＦ１５／１９亚家族）在于细胞内的ＦＧＦ亚家族（ＦＧＦ１１亚家族）。经典的旁分泌的家族主几个家族：ＦＧＦ１亚家族，ＦＧＦ４亚家族，ＦＧＦ７亚家族，ＦＧＦ８亚家邋亚家族（图邋１．１）邋［４，邋１９－２１］。逡逑Ｃｏｆａｃｔｏｒ：邋Ｈｅｐａｒｉｎ／Ｈｅｐａｒａｎ邋ｓｕｌｆａｔｅ逡逑－一逡逑

逦逦逡逑因库中得到的ｃＤＮＡ具有高度的同源性（９０－１００％是在激酶区），同时，ＦＬＧ邋—逡逑部分的ｃＤＮＡ的克隆，与大鼠中Ｂｅｋ中克隆的ｃＤＮＡ序列有８４％的基因同源性逡逑［６７］。Ｂｅｋ就是现在的ＦＧＦＲ２，同源基因的克隆促进了邋ＦＧＦＲ３和ＦＧＦＲ４基因的逡逑发现［６８－７１］。逡逑１．２．１成纤维细胞生长因子受体的结构元件逡逑Ｎ端含有一个疏水的信号肽，三个胞外的免疫球蛋白的结构，一个胞内的激逡逑酶结构域，，由跨膜的螺旋区和近膜区连接起来。ＦＧＦＲ蛋白的胞外端有三个免疫逡逑球蛋白状结构域（ＤＩ，邋ＤＩＩ和ＤＩＩ），Ｎ端起始是一段２２氨基酸的信号肽，在逡逑ＤＩ和ＤＩＩ的连接处有一个酸盒（一段酸性的氨基酸序列），紧接着是ＤＩＩ和Ｄｉｌｉ逡逑结构域（图１．２）邋［７２－７４］。ＤＩＩ和Ｄｉｌｉ以及它们之间的连接区域决定了邋ＦＧＦＲ与逡逑配体结合的选择性和特异性。ＤＩ和酸盒在胞外端作为自抑制的结构存在，当逡逑ＦＧＦＲ胞外端的ＤＩ和Ｉ－ＩＩ之间的连接区域被选择性剪切掉之后，ＦＧＦＲ与相应的逡逑ＦＧＦ的亲和性得到了增强，这一现象印证了邋ＤＩ及其连接区域在配体结合过程中逡逑确实存在自抑制的作用［７５］。逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;R341

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本文编号：2676161