胰岛素急性中毒半数致死量测定及低血糖脑损伤模型的建立

发布时间：2020-05-23 04:18

【摘要】：【研究背景】胰岛素是一种内源性降糖激素,但外源性胰岛素过量会导致人体严重毒副作用,如惊厥、角弓反张、低血糖昏迷,甚至死亡。随着胰岛素的广泛使用,因胰岛素过量造成意外、自杀、甚至他杀案件也日趋增多。国内外报道胰岛素他杀的案件已经愈发难以控制。由于胰岛素过量死亡缺乏特异性病理学改变,死后也难以进行药(毒)物分析,所以这个科学难题也一直困扰着国际司法鉴定领域,而因此,研究动物胰岛素过量急性中毒半数致死量,建立胰岛素过量低血糖脑损伤动物模型是研究其中毒症状、组织病理、死亡机制及对应法医鉴定对策的基础及前提。胰岛素中毒主要依据血液中测得的胰岛素、血糖水平进行诊断,但血胰岛素、血糖水平随着死亡时间变化而发生的死后化学变化,从而干扰其真实的浓度或含量导致无法应用于法医鉴定。由于死后红细胞自溶释放血红蛋白,导致胰岛素迅速降解、尸体血液中胰岛素远低于生前实际水平;从死后尸体血中尽快提取并分离血清,可更好地保存死后血清的质量、降低溶血的影响而被推荐于胰岛素中毒的法医鉴定。然而,在法医病理学领域,用于毒理学和生化检查的血液很少在死亡后能够立即收集和离心。的确,在法医尸检案件中,获得能够适用于死后胰岛素定量的血清样本是一种奢望。此外,由于基质干扰、各种循环抗体和胰岛素降解酶降解胰岛素,以及死后溶血的影响,死后血液中测定的胰岛素的数据也不能反映死者生前的胰岛素水平。因此,除非死后迅速解剖或保留死者生前血清,否则难以通过检测尸体血液中胰岛素或血糖水平进行胰岛素中毒致死的法医学诊断。目前,低血糖脑病(hypoglycemia encephalopathy,HE)被认为是胰岛素中毒致死的主要机制。葡萄糖是大脑内最主要的能量来源,当血糖≤2.0 mmol/L时,脑内葡萄糖浓度接近于零,出现意识模糊、昏迷等,如昏迷时间超过30min,则导致中枢神经系统(CNS)不可逆性损害。因此,本研究基于上述理论基础,拟首先测定胰岛素急性中毒半数致死量,在此基础上建立大鼠低血糖脑损伤的模型,为后续实验奠定坚实的基础。本实验首先通过研究小鼠胰岛素急性中毒来观察胰岛素急性中毒对小鼠的行为影响,并且测定小鼠胰岛素急性中毒半数及95%致死量,之后根据Auer等早期在Acta Neuropathold中推荐的方法,建立大鼠胰岛素过量致低血糖脑损伤模型,完成后续神经病理学研究。为全面揭示胰岛素过量致低血糖脑损伤的病变机制及胰岛素中毒死亡的法医学诊断提供科学依据。【研究目的】(1)测定小鼠胰岛素急性中毒半数致死量(LD50),并推测胰岛素中毒95%致死量(LD95);(2)观察并记录小鼠胰岛素急性中毒表现;(3)建立胰岛素过量致大鼠低血糖脑损伤的模型。【研究方法】(1)测定小鼠胰岛素急性中毒半数致死量(LD50):将60只昆明(KM)小鼠随机分为6组进行试验,每组10只,其中雌雄各半。随后将实验KM鼠进一步分为5个剂量的胰岛素急性染毒组和假手术对照组。其中急性染毒组分别给予单次0.7 IU/kg、1.9 IU/kg、4.9 IU/kg、13.0 IU/kg、34.5 IU/kg的胰岛素溶液腹腔注射;对照组小鼠给予单次生理盐水0.1ml腹腔注射;观察小鼠胰岛素急性中毒死亡的行为改变及存活率。根据上述5个染毒组(每组10只小鼠)所得的死亡率数据,使用孙氏改良寇氏法(点斜法)及Bliss法计算小鼠腹腔注射胰岛素急性中毒LD50;(2)观察小鼠胰岛素急性中毒后的行为表现;(3)建立胰岛素过量致大鼠低血糖脑损伤的模型:将55只SD(Sprague Dawley)成年的雄性大鼠随机分为急性低血糖组、复苏组及1个空白对照组(各9只)。根据Auer等早期在Acta Neuropathold中推荐的方法,建立大鼠胰岛素过量致低血糖脑损伤模型,完成后续神经病理学研究。(4)探讨大鼠胰岛素中毒大脑的病变特点。【结果】(1)小鼠胰岛素中毒的LD50:使用点斜法(孙氏改良寇氏法)及Bliss法计算小鼠胰岛素腹腔注射急性中毒LD50,得到LD50较为接近,为10.0 IU/Kg;(2)急性中毒表现:胰岛素中毒染毒组小鼠均出现2种较为稳定的症状,即呆滞及后肢无力。染毒后部分小鼠还出现如惊厥、角弓反张(表现为项背高度强直,使身体仰曲如弓状的病症)及二便失禁、昏迷等症状,其出现频率随时间的增长而增加;(2)神经病理学改变:大鼠胰岛素中毒模型可观察到海马(尤其CA1区、CA3区、齿状回嵴)、大脑皮质浅层(尤其第Ⅱ、Ⅲ层)等区域出现选择性神经元坏死,而海马神经元在病程迁延或低血糖葡萄糖再灌注后坏死更为明显;【结论】(1)通过应用单次0.7 IU/kg、1.9 IU/kg、4.9 IU/kg、13.0 IU/kg、34.5 IU/kg的胰岛素腹腔注射染毒,计算出小鼠LD50为10.481 IU/kg,LD95为99.75 IU/kg;(2)通过应用单次注射0.7 IU/kg、1.9 IU/kg、4.9 IU/kg、13.0 IU/kg、34.5 IU/kg的胰岛素腹腔注射可以观察到小鼠胰岛素急性中毒后的行为表现。染毒后迅速发生的后肢无力及间歇性的惊厥、角弓反张抽搐可以作为染毒成功的表现;(3)建立胰岛素过量致低血糖脑损伤的模型,通过低血糖脑损伤神经病理学研究,发现海马损伤是胰岛素过量的一个特征性病理改变,为后续低血糖脑病的研究奠定基础。
【图文】：

脑电图,大鼠,低血糖,等电位

2.1 动物急性中毒表现表现大鼠注射胰岛素后血糖≤3.0mmol/L 时即可出现呆滞、后肢无力，惊厥、轻度抽搐，肌紧张增强，部分大鼠出现二便失禁、严重抽搐。低血糖复苏组大鼠麻醉清醒后主要表现为反应迟钝、呆滞不动、不思饮食，其症状随伤后存活时间延长而缓解。本实验中低血糖复苏组总体死亡率达 50%，其中复苏后短时间内死亡的大鼠主要表现为呼吸暂停后难以恢复自主呼吸。2.2 脑电图(EEG)检测结果胰岛素注射后前期，可观察到明显的脑电活动。然后，观察到高振幅慢波，其中有尖锐的波状成分，随后出现不规则或有节奏的尖波，最终出现等电位脑电图即平波现象。在研究低血糖脑损伤时，只有当脑电图（EEG）长时间变为等电位时,大鼠低血糖昏迷并对中枢神经系统造成不可逆性损伤，大脑神经元开始死亡。

脑组织,海马,HE染色,实验组

华中科技大学硕士学位论文2.3 脑组织大体观察肉眼观察实验组组及对照组所有大鼠均未见颅骨骨折及硬膜外血肿的形成。实验组脑组织表面血管轻度扩张充血。但未见蛛网膜下腔出血、脑挫裂伤及脑挫伤。对照组的大鼠脑组织未发现异常。2.4 HE 染色HE 染色结果显示实验组均表现为不同程度的异常，急性低血糖组（图 2b）可见神经元肿胀，体积增大，但未见坏死，而复苏组（图 2c）可见齿状回脊颗粒神经元的脱失，，CA1 区神经元坏死，对照组（图 2a）大鼠海马区域无异常表现。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R595.4

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