手足口病毒鸡卵黄抗体的制备及抗病毒作用研究

发布时间：2020-05-23 03:34

【摘要】：目的:本实验通过制备抗肠道病毒71型鸡卵黄抗体(anti-EV71 IgY),开展其在体内及体外抗肠道病毒71型(EV71),体外抗柯萨奇病毒A16型(CVA16)的相关检测,并对其抗EV71和CVA16的作用机制进行探讨。以期探索出一种新的能交叉被动免疫治疗由EV71和CVA16引发的手足口病(HFMD)方案。方法:以EV71毒株作为抗原,与弗氏不完全佐剂1:1混合并吹打使其乳化均匀,通过多次注射来免疫SPF级母鸡,收集并提取纯化IgY;蛋白定量法检测IgY的总蛋白浓度;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试IgY纯度;采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)来评价特异性IgY的浓度变化规律;蛋白质印记法和免疫双向琼脂扩散法检测纯化IgY的特异性;采用观测人横纹肌肉瘤细胞(RD)的细胞病变效应(CPE)检测特异性IgY体外对EV71与CVA16中和能力的量效关系,抗EV71稳定性和时效性;通过免疫荧光法检测特异性IgY在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的抗EV71作用;灌胃给药检测特异性IgY对被EV71病毒感染的新生BALB/c鼠的保护作用。结果:IgY总蛋白浓度在免疫后整体呈上升趋势;SDS-PAGE电泳图显示纯化的IgY纯度良好,可被分裂为分子量约为70 kDa的IgY重链(H)及30 kDa的IgY轻链(L);通过ELISA我们发现特异性IgY浓度在免疫后的第7天出现增加,在第7周达到最高,并在较高水平维持4周左右;免疫双向琼脂扩散实验与Western blot测得特异性IgY具有与EV71、CVA16毒株良好的免疫结合性,能特异性识别EV71和CVA16的包膜蛋白VP1及VP3;IgY体外中和病毒实验结果显示,特异性IgY能抑制EV71病毒和CVA16病毒的感染病变能力,并呈剂量-效应相关关系,差异具有统计学意义;特异性IgY在感染早期对EV71病毒有很强的抑制作用,感染后期抑制效果不明显;特异性IgY在4℃、室温、37℃条件下48 h后抗病毒活性依然稳定,60℃条件下1.6μg/mL仍能对病毒达到100%的抑制率。反复冻融5次后对IgY的抗病毒活性没有影响。特异性IgY对肠道病毒EV71、CVA16有很强的抑制活性,对其他肠道病毒抑制效果不明显;免疫荧光法显示特异性IgY在3.72μg/mL对Vero细胞中的毒株能达到近乎100%的抑制作用;特异性IgY实验组新生鼠生存率达到100%,相比于对照组无消瘦,精神萎靡,毛发生长异常等症状。结论:(1)免疫后提取的特异性IgY纯度与抗病毒特异性良好。(2)特异性IgY能识别EV71、CVA16病毒的包膜蛋白VP1与VP3,在体外抗病毒实验中能有效地抑制EV71病毒和CVA16病毒活性并呈剂量-效应相关关系。(3)特异性IgY作用于EV71感染早期处理明显优于后期,并且特异性IgY的稳定性较好。(4)特异性IgY灌胃给药后可以对被EV71攻击的乳鼠提供保护。
【图文】：

24图2 初次免疫后特异性IgY的变化规律Figure 2. The development pattern of specific IgY after primary immunization2.4 免疫双向琼脂扩散实验根据免疫双向琼脂扩散实验，初次免疫后第 7 周卵黄抗体的特异性如图 A 和 B，中心 EV71 与 CVA16 毒株抗原孔与周围以 1:2、1:4 和 1:8 稀释的特异性 IgY 抗体孔之间出现了明显的白色免疫沉淀线，而阴性对照 PBS孔与抗原孔之间没有出现免疫沉淀线，表明制备的特异性 IgY 具有与 EV71和 CVA16 毒株特异结合的能力。

25图3 免疫双向琼脂扩散实验，特异性IgY对EV71毒株和CVA16毒株的免疫结合性分析。(A) EV71的双向免疫琼脂扩散；(B) CVA16的双向免疫琼脂扩散。Figure 3. Agar Double Immunodiffusion， characterization of the specific IgY against EV71 strain andCVA16 strain. (A) Bidirectional immune agar diffusion test for EV71. (B) Bidirectional immune agardiffusion test for CVA16.2.5 Western blot 蛋白检测纯化 IgY 特异性WB 结果显示特异性 IgY 抗体在图 A 和 B 的 1、2 泳道能特异性识别EV71 和 CVA16 病毒的 VP1（36 kDa）与 VP3（28 kDa）[51, 52]蛋白，产生良好的免疫结合反应。而对照组 IgY 不能识别两种病毒的包膜蛋白（5、6泳道），提示对照组 IgY 不具有与病毒的免疫反应性。用商品化 VP1 单克隆抗体对 EV71 和 CVA16 抗原的 VP1 蛋白进行验证，结果如图 A 和 B 的第 5、6 泳道所示，，验证了电泳后 VP1 蛋白分子量。用商品化 VP1 蛋白对制备的IgY 进行验证，结果如图 C
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392-33

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本文编号：2677081