弓形虫酪氨酸羟化酶1功能的初步研究

发布时间：2020-05-23 03:05

【摘要】：一.研究背景刚地弓形虫(Toxoplasmagondii,Tgondii)是一种专性细胞内寄生原虫,能够感染大多数温血动物。弓形虫是顶复门原虫的成员,由于弓形虫的地理分布和中间宿主的多样性,使得其成为世界上分布最广的寄生虫之一。弓形虫在各种中间宿主中进行无性增殖,包括人类在内。在感染中间宿主时,弓形虫分化成速殖子,并迅速在宿主体内传播。虽然大多数速殖子被免疫系统清除,但一些速殖子转变为缓殖子,在脑和肌肉中形成相对静止的组织包囊。在大多数免疫正常人群,弓形虫感染为一过性甚至是无临床表现,而对于免疫低下人群则会造成弓形虫眼病、弓形虫脑病甚至死亡,对于孕妇会造成流产、畸胎、严重的先天性缺陷包括眼部疾病和发育迟缓甚至死胎等严重危害由于弓形虫急性感染的危害性相对严重,以往的研究更多关注的是弓形虫速殖子,而认为在脑和肌肉中形成的相对静止的组织包囊在宿主体内不起作用。但近几年的研究表明,被弓形虫感染的啮齿动物表现出不寻常的行为反应:它们失去了对猫尿气味的本能厌恶,反而被猫尿气味吸引,这种行为改变看起来有利于弓形虫由中间宿主向终宿主传播。虽然这种行为操纵的确切机制尚不清楚,但是寄生于大脑中的弓形虫能够通过刺激宿主多巴胺(dopamine,DA)通路使其调控发生改变进而操纵宿主行为已被认为是一个可能的机制。有研究者已经提出,速殖子在体外可以改变DA水平,脑内包囊可以直接影响宿主大脑中的DA产生和DA突触传递。另外,用于治疗精神分裂症的多巴胺受体拮抗剂氟哌啶醇,同时也能抑制弓形虫增殖且用药后患者抗弓形虫抗体滴度水平下降。而抗精神病药物联合蒿甲醚治疗能显著改善精神分裂症患者部分精神症状并且降低弓形虫抗体阳性率。这都说明了弓形虫感染可能与宿主脑内多巴胺水平相关,但其引起多巴胺改变的可能机制尚不清楚。在弓形虫基因组包含两个编码芳香族氨基酸羟化酶:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的基因,TgAaaH1和TgAaaH2。酪氨酸经化酶将酪氨酸转化为多巴胺前体左旋多巴(3,4二羟基苯丙氨酸,L-Dopa),是后续多巴胺合成的限速步骤。有研究表明弓形虫中编码的芳香族氨基酸羟化酶的AAH1和AAH2基因有助于弓形虫向猫的传播而完成有性生殖,在弓形虫卵囊发育中起重大作用。由于AAH2在弓形虫速殖子中以低水平表达,在缓殖子中表达上调,以往更多对AAH2的功能进行研究。有研究发现AAH2基因不影响弓形虫速殖子期的功能或感染宿主脑中多巴胺的全局或区域性改变,也不影响慢性弓形虫感染BALB/c小鼠的DA依赖性神经异常行为。但对于AAH2基因的功能存在争议没有定论,而对于在速殖子期和缓殖子期都有相当量表达的AAH1基因的功能研究较少。那么AAH1是否在弓形虫的生长发育中有特殊功能或者参与了寄生虫操纵宿主DA,进而影响宿主的行为改变?为了探究这种可能性,我们构建了Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株的AAH1基因敲除虫株,探究AAH1基因在速殖子阶段对弓形虫入侵宿主细胞,在宿主细胞内增殖和生长的影响;并且构建动物模型以直接探究弓形虫AAH1基因的敲除对弓形虫急性感染小鼠毒力作用、弓形虫慢性感染小鼠脑组织成囊能力的影响,以及通过监测小鼠的行为来探究AAH1基因在弓形虫缓殖子阶段的功能。二.方法1.利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR.),构建单拷贝pUC19-SAG1-AAH1质粒作为基底对照,检测AAH1基因在Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株基因组中的拷贝数。2.应用CRISPR/Cas9技术,在AAH1基因第7个外显子定向插入乙胺嘧啶基因作为药筛标签,通过插入失活,以达到敲除AAH1基因功能目的,并在基因组及转录组水平证明插入失活。3.通过结晶紫染色、免疫荧光染色法量化弓形虫在体外入侵HFF细胞、以及在细胞内增殖和生长能力,通过CD-1小鼠腹腔感染速殖子建立急性小鼠感染模型,观察弓形虫AAH1基因敲除对感染小鼠的毒力作用的影响,来探究弓形虫AAH1基因在速殖子期的功能。4.通过包囊经口灌胃来建立慢性感染小鼠模型,观察弓形虫AAH1基因敲除株慢性感染小鼠脑组织内包囊的空间分布,利用旷场实验和Morris 水迷宫,观察弓形虫AAH1基因敲除株慢性感染小鼠的行为改变,来探究弓形虫AAH1基因在缓殖子期功能。三.结果1.AAH1基因在RH和PRU株基因组中为单拷贝。2.成功构建RHAAAH1和PRUAAAH1敲除株。3.建立弓形虫急性和慢性感染的CD-1小鼠模型。4.弓形虫AAH1基因敲除不影响弓形虫对宿主细胞的入侵,在宿主细胞内增殖和生长的能力,以及对弓形虫急性感染小鼠的毒力作用。5.弓形虫AAH1基因敲除会影响弓形虫慢性感染小鼠脑脑组织整体包囊负荷和局部包囊的形成。6.弓形虫AAH1基因敲除不影响弓形虫慢性感染小鼠在旷场实验中的自主行为和探索行为,以及在Morris水迷宫的空间学习相关行为,但会影响弓形虫慢性感染小鼠在Morris水迷宫中记忆保持能力。四.结论AAH1基因的敲除不影响弓形虫Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株对宿主细胞的入侵、在宿主细胞内的增殖和生长能力,以及对弓形虫急性感染小鼠的毒力作用。同时,AAH1基因的敲除不影响弓形虫Ⅱ型PRU株慢性感染小鼠在新环境中的自主行为、探索行为以及在Morris水迷宫中的学习相关行为,但是会影响弓形虫Ⅱ型PRU株慢性感染小鼠脑内包囊形成能力,以及在Morris水迷宫中的记忆相关行为。
【图文】：

技术路线图,学位论文,路线

AAHI基因拷贝数鉴定的技术路线图

路线图,虫株,基因敲除,引物设计

图１－２邋ＡＡＨ１基因敲除虫株构建的技术路线图逡逑２．２引物设计及合成逡逑本实验中引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，，具体见下表。逡逑表１－１本研究中所用引物逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ．逡逑引物名称逦引物序列逦ｍ逡逑ＡＡＨｌ－Ｆ逦ＣＣＣ邋ＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣ邋ＡＧＧＣＣ邋ＡＴＴＴＴＣＧＣＴＧ逡逑扩增ＡＡＨ１基因逡逑ＡＡＨ１－Ｒ逦ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＣＴＡＣ邋ＡＧ邋Ａ邋ＡＴＧ邋ＡＴＡＴＧＣ邋ＡＡＡＴＣＣ邋ＡＴＧ逡逑ＵＣｌ邋９－ＳＡＧ邋１－Ｆ邋５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＧＣＣＣＴＡＡＡＡ邋扩增邋ＳＡＧ１邋片段构建逡逑ｐＵＣ邋１９－Ｓ邋ＡＧ－Ｒ逦５，－ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣ邋ＡＴＡＣ邋ＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣＧＴＣＧＴ－３邋’逦ｐＵＣ邋１９－ＳＡＧ邋１邋－Ａ邋ＡＨ邋１逡逑１２逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R382.5

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