神经肽P物质对NK-92MI细胞迁移及趋化因子受体表达的影响

发布时间：2020-05-24 22:15

【摘要】：目的:自然杀伤细胞(NK cell)是免疫系统不可或缺的防卫细胞,NK细胞可利用细胞毒活性杀死入侵机体的病原体,并对肿瘤免疫发挥关键性作用。脾、肺、肝和子宫等器官的组织和外周循环血中都有NK细胞的聚集。当机体被感染或发生癌变时,机体组织和循环血内的NK细胞会受到细胞因子等的趋化,调节NK细胞迁移功能,促进NK细胞向炎症病灶和癌变区域转移。SP是一种主要由神经系统分泌的神经肽类物质,主要参与神经调节,也可参与机体免疫调节和炎症反应。目前,研究发现SP与免疫系统关系密切,能增强NK细胞的增殖并活化免疫细胞,是体内必不可少的调节性多肽,对炎症发生时免疫细胞的募集也有重要作用。NK细胞受机体内各种趋化性物质的调节,促进细胞迁移活动的发生,发挥细胞毒作用杀死病原微生物或癌变细胞。本研究通过检测SP对NK92-MI细胞迁移能力和细胞表面趋化因子受体表达的影响,探讨SP对NK细胞的迁移活性的直接或间接调控作用;并通过测定SP对NK92-MI细胞上CCR7、CXCR3和CXCR4表达水平的影响,以及SP受体NK-1R在SP调控NK92-MI细胞迁移活性中的作用,进一步讨论SP调控NK细胞迁移活性的机制。研究方法:(1)Transwell法检测不同浓度的SP(10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L)对NK92-MI细胞迁移能力的影响以及不同浓度SP对趋化因子CCL21(CCR7配体)和CXCL12(CXCR4配体)对NK92-MI细胞趋化作用的影响。(2)Real-time PCR检测不同浓度的SP(10-12 mol/L~10-6 mol/L)对NK92-MI细胞趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA表达水平的影响。(3)流式细胞术检测不同浓度的SP(10-12 mol/L~10-6 mol/L)对NK92-MI细胞趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4膜表达的调控。(4)NK-1R拮抗剂作用NK92-MI细胞后,再用Transwell法测定不同浓度SP及趋化因子CCL21和CXCL12对NK92-MI细胞的趋化作用;Real-time PCR测定趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA表达水平的变化。结果:(1)SP对NK92-MI细胞的直接趋化作用,在10-12 mol/L~10-10 mol/L浓度范围内,随SP浓度增高,NK92-MI细胞的迁移力也逐渐增强,10-10 mol/L浓度SP的促迁移作用最强;其后,SP浓度继续增高,其促迁移作用反而逐渐减弱。不同浓度SP同样可以增强趋化因子CXCL12和CCL21对NK92-MI细胞的趋化作用,在低浓度范围(10-12 mol/L~10-10 mol/L)SP作用下,NK92-MI细胞迁移力逐渐增加,而随着SP浓度继续增高(10-8 mol/L~10-6 mol/L),NK92-MI细胞迁移力又有所减弱。(2)SP可明显增加趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4的m RNA表达。10-12mol/L~10-6 mol/L浓度范围的SP作用NK92-MI细胞6h,CCR7、CXCR3和CXCR4的m RNA表达均明显增高;仅在10-12 mol/L浓度组,CXCR4的m RNA表达增高不明显,与对照组相比无统计学意义。SP作用NK92-MI细胞12h,各浓度(10-12mol/L~10-6 mol/L)SP仍能显著促进CXCR3和CXCR4的m RNA表达,而CCR7的m RNA表达水平无明显增高。(3)10-12 mol/L~10-6 mol/L浓度范围的SP对趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4的膜表达作用各不相同,其中CCR7的表达具有随着SP浓度的增高而增加的趋势,在10-8 mol/L和10-6 mol/L浓度组CCR7的表达有显著增加(P0.05);经各浓度SP作用后,CXCR3的表达水平与对照组相比有所增加,但无统计学差异;而CXCR4表达则随SP浓度的增高,具有先增高后回降的趋势,10-10 mol/L和10-8 mol/L浓度的SP对CXCR4表达有明显的促进作用(P0.01、P0.05)。SP对三种趋化因子受体表达的作用趋势与SP促进NK92-MI细胞迁移能力的作用趋势不完全一致,提示存在有各趋化因子受体的竞争表达,或可能还有其他趋化因子受体在协同发挥作用。(4)经NK-1R拮抗剂处理后,SP、CCL21和CXCL12均不能明显增加NK92-MI细胞的迁移活性,且各浓度SP对CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA的表达无明显促进作用,说明NK-1R拮抗剂发挥了阻断作用,提示NK-1R是SP调控NK细胞迁移活性发挥作用的途径。结论:SP能直接促进NK92-MI细胞的迁移,说明SP对NK细胞具有直接趋化作用;SP能增加NK92-MI细胞表面趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4的表达,并增强相应趋化因子CCL21和CXCL12对NK92-MI细胞的趋化作用,说明SP可通过上调一些趋化因子受体的表达,间接调控NK细胞的迁移活性;SP对NK92-MI细胞迁移活性的调控是通过其受体NK-1R来发挥作用的。
【图文】：

3.1 SP 对 NK92-MI 细胞迁移能力的影响3.1.1 SP 对 NK92-MI 细胞迁移能力的影响与对照组相比，在 10-12mol/L 10-10mol/L 浓度范围内，随着 SP 浓度的增加，NK92-MI 细胞迁移力(趋化指数)逐渐增强，在 10-10mol/L 浓度时 SP 的趋化作用最强(P<0.01)，说明 SP 可直接促进 NK92-MI 细胞的迁移。随后，SP 浓度继续增加，NK92-MI 细胞迁移力反而逐渐减弱，结果如表 5、图 1 所示。表 5. SP 对 NK92-MI 细胞迁移能力的影响SP 浓度(mol/L) SP 对 NK92-MI 细胞的趋化指数对照 1.0010-121.84±0.16*10-103.17±0.17**10-82.56±0.34**10-61.78±0.22**与对照组(未经 SP 处理)相比 P<0.05，**与对照组相比 P<0.01。

图 2. SP 增强趋化因子 CCL21/CXCL12 对 NK92-MI 细胞的趋化作用(HE 染色 transwell 图)；A趋化因子 CCL21 对 NK92-MI 细胞的趋化作用，B.趋化因子 CXCL12 对 NK92-MI 细胞的趋化作用3.2 SP 对 NK92-MI 细胞趋化因子受体 CCR7、CXCR3 和 CXCR4 mRNA表达的影响SP 对 NK92-MI 细胞表达的三种趋化因子受体的 mRNA 表达具有促进作用。①浓度范围为 10-12mol/L 10-6mol/L 的 SP 刺激 NK92-MI 细胞 6h，均可明显促进CCR7 的 mRNA 表达(P<0.01)，且随着 SP 浓度的增高，其 mRNA 表达水平也增高(结果见图 3A)。而刺激 12h 后，各浓度 SP 对 CCR7 的 mRNA 表达均无明显作用(结果见图 3B)。②浓度范围为 10-12mol/L 10-6mol/L 的 SP 刺激 NK92-MI 细胞 6h，，CXCR3 的 mRNA表达均可明显增加。在 10-12mol/L 10-10mol/L 浓度范围内，随 SP 浓度逐渐增加，
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392.1

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本文编号：2679073