维生素D在新生鼠哮喘模型中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-26 12:24

【摘要】：背景:支气管哮喘是由多种炎症细胞共同参与的以慢性气道炎症和气道高反应为特征的疾病。哮喘的发病机制复杂,临床分型多样,以过敏性哮喘最为常见,大多数儿童以及50%的成年人哮喘均属于过敏性哮喘。目前认为过敏性哮喘是由Th2细胞和ILC2细胞所介导,以呼吸道2型细胞因子(IL-4,IL-5和IL-13)水平增高、杯状细胞化生及黏液分泌、嗜酸粒细胞浸润以及血清Ig E水平增高等作为典型表现的气道炎症反应。维生素D是人体必需的一种脂溶性维生素,不仅可调节钙磷代谢和促进骨骼发育,亦可通过与受体结合调节免疫细胞的功能。维生素D在哮喘中的研究尚存在争议,这些结果的不一致性提示,维生素D发挥免疫调节的功能与其干预的时间和干预剂量、以及机体年龄和遗传背景等因素相关。为确定维生素D干预在过敏性哮喘中的作用,我们在本研究中建立OVA诱导的BALB/c和C57BL/6新生鼠/成年鼠过敏性哮喘模型,分别在致敏期和激发期给予具有生物活性的维生素D代谢产物1,25(OH)2VD3(以下简称VD),观察VD干预的剂量、时相对不同品系、不同年龄小鼠OVA诱导的过敏性炎症反应的影响,并进一步探讨其作用机制,为维生素D应用于过敏性哮喘的防治提供实验依据。目的:1.研究VD干预的剂量、时相对不同品系、不同年龄小鼠OVA诱导的过敏性反应的影响;2.探讨VD干预的可能机制。方法:1.OVA诱导的过敏性哮喘模型的建立:应用C57BL/6或BALB/c新生鼠(≤7天)及成年鼠(6-8周),造模分为致敏阶段和激发阶段。致敏阶段于第0天和第7天经腹腔注射OVA与氢氧化铝佐剂的混悬液(含有10μg OVA和2mg Alum的50μl生理盐水),成年鼠剂量加倍;激发阶段于第14天开始连续6天雾化1%OVA溶液,每天雾化30min,对照组雾化相同时间生理盐水;2.实验分组及VD干预方案:实验分为四组:对照组(Saline/saline),哮喘组(OVA/OVA),VD致敏期干预组(VD/OVA/OVA)和VD激发期干预组(OVA/VD/OVA)。VD致敏期干预组小鼠在两次致敏前一天(-1天和第6天)腹腔注射1,25(OH)2VD3;VD激发期干预组小鼠在第13天和第16天腹腔注射1,25(OH)2VD3。依据参考文献,将VD干预剂量定为5ng/g,之后根据实验结果进行调整;3.检测VD干预对不同品系及不同鼠龄动物过敏性炎症反应的影响,最后一次雾化24h后收集样本。肺组织经胶原酶D消化后制备单细胞悬液,采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测肺脏嗜酸粒细胞的浸润;肺组织切片进行高碘酸希夫染色(periodic Acid-Schiff stain,PAS)及苏木精-伊红染色(hematoxylin-sosin staining,HE),观察杯状细胞化生及炎性细胞浸润;ELISA检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)或支气管旁淋巴结(Peribronchial lymph node,PBLN)细胞培养上清中细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-10以及IL-17A水平以及血清中Ig E、Ig G1和Ig G2a水平;4.探讨VD干预的可能机制:采用FCM检测肺脏免疫细胞,包括Th细胞、效应T细胞、Treg、树突状细胞(dendritic cell,DC)亚群及ILC2细胞的组成;ELISA检测肺匀浆及BALF中上皮细胞来源细胞因子包括CCL-20、GM-CSF及IL-33的水平。5.探讨致敏期VD干预在新生鼠模型中发挥保护作用的机制:B6新生鼠于第二次OVA致敏48h后处死,收集小鼠PBLN,采用FCM检测PBLN中DC和T细胞的变化;在第二次致敏2h后收集小鼠腹腔灌洗液,ELISA检测上清中的尿酸水平。结果:1.在BALB/c小鼠哮喘模型中,新生鼠和成年鼠经OVA激发BALF中均出现大量嗜酸粒细胞的浸润,呼吸道杯状细胞化生及黏液分泌增加,肺组织血管及呼吸道周围大量炎性细胞浸润。当给予BALB/c小鼠参考剂量5ng/g VD干预时,无论是致敏期或激发期进行VD干预均使小鼠体重大幅下降,与对照组相比有显著性差异。当VD剂量调整为2ng/g时,小鼠体重维持在正常水平,且此时在两年龄组小鼠中不同阶段VD干预均可明显抑制过敏性炎症反应;2.在C57BL/6(B6)小鼠哮喘模型中,新生鼠和成年鼠经OVA激发后均出现过敏性炎症反应。当给予2ng/g VD进行干预后其VD干预的效果与BALB/c小鼠并不一致。新生鼠致敏期VD干预可明显缓解BALF和肺脏中嗜酸性粒细胞的浸润,而激发期VD干预则无保护作用。成年鼠致敏期VD干预并不影响肺脏嗜酸粒细胞的浸润,而激发期VD干预非但没有保护作用,反而诱导了更为严重的嗜酸粒细胞浸润(p0.01)。肺组织切片染色结果在两年龄组小鼠中也呈现同样的趋势;3.已经发现,维生素D缺乏的儿童患哮喘的风险会大大增加。另外,考虑到后续机制研究需应用基因缺陷鼠多为B6背景,为此本课题中我们聚焦于VD干预在B6新生鼠模型中的作用。综合上述实验结果,我们将VD干预的工作剂量调整为4ng/g,此剂量不影响B6小鼠体重和健康状态。B6新生鼠经OVA激发后出现典型过敏性炎症反应,表现为BALF和肺脏中均出现大量嗜酸粒细胞的浸润,并伴随中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞的增多,有显著性差异;呼吸道上皮有大量PAS染色阳性的杯状细胞化生以及黏液分泌,BALF中Th2相关细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)水平均明显升高以及血清Ig E水平增高,有显著性差异。而致敏期或激发期VD干预均可缓解过敏性炎症反应;4.相比于OVA/OVA组,PBLN培养上清中Th2相关细胞因子IL-4,IL-5及IL-13的水平在VD干预后均明显降低,肺脏中IL-4+,IL-5+和IL-13+CD4+T细胞数目亦大幅减少。Treg在各组之间无统计学差异。另外致敏期VD干预可明显减少肺脏效应T细胞数目(p0.05),且抑制PBLN中T细胞的活化,激发期干预则无影响;5.相比于OVA/OVA组,致敏期VD干预明显减少肺脏中CD11b+DC的数目(p0.05),激发期干预无影响。此外VD干预组小鼠于OVA第2次致敏48h后检测发现其PBLN中CD11b+DC的数目减少,其表面共刺激分子CD86及OX40L表达下降。致敏期或激发期VD干预均可明显降低肺匀浆和BALF中CCL20的水平,而对GM-CSF水平则无影响;6.致敏期或激发期VD干预均能明显减少OVA引起的ILC2细胞在肺部的集聚(p0.05)及其分泌IL-5和IL-13的水平。相比于OVA/OVA组,两阶段VD干预均可明显降低肺匀浆中IL-33的水平,有显著性差异。激发期VD干预还可降低BALF中IL-33的水平;7.致敏期腹腔注射OVA和氢氧化铝佐剂的混悬液可引起腹腔尿酸水平的升高(p0.05),致敏期VD干预后可明显降低腹腔尿酸的水平(p0.05)。结论:1.VD干预的剂量和时相、小鼠的遗传背景和年龄均可影响VD干预的效果;2.VD干预可明显减少肺脏中CD11b+DC的数目并降低其表面共刺激分子的表达,从而抑制T细胞的活化与分化;VD干预可明显抑制上皮细胞分泌IL-33,减少ILC2细胞在肺部的集聚及其分泌细胞因子的水平;3.VD干预可明显降低OVA和氢氧化铝佐剂致敏引起的腹腔尿酸水平的增高,这是VD在致敏期发挥保护作用的重要机制。
【图文】：

图 1. 过敏性哮喘模型的建立及 VD 干预方案表 1.实验分组实验分组 处理方式新生鼠/成年鼠阴性对照组 Saline/Saline哮喘组 OVA/OVA

15图 3. 同等剂量 VD 干预在 C57BL/6 小鼠模型中显示不同的效果A，，B：VD 干预剂量为 2ng/g，FCM 检测新生鼠 BALF 和肺脏中嗜酸性粒细胞等各种炎性细胞的浸润。C，D：流式检测成年鼠 BALF 和肺脏中嗜酸性细胞等各种炎性细胞的浸润。E，F：新生鼠和成年鼠肺组织切片 H&E 和 PAS 染色
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R562.25;R-332

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