金黄色葡萄球菌效应调节因子ArlR以及钝节螺旋藻Ap-phr蛋白的结构和功能研究

发布时间：2020-05-27 02:48

【摘要】：金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性致病菌。该菌广泛地存在于环境中,可寄生各类宿主。金黄色葡萄球菌寄生在人体后,会造成一系列的疾病,小到皮肤、软组织感染,大至危害性命的疾病,例如肺炎、骨髓炎、败血症和感染性心肌炎等。目前临床上多用抗生素来治疗金黄色葡萄球菌感染,但伴随抗生素的长期使用,临床上已进化出抗甲氧西林金黄色葡萄球菌和抗万古霉素金黄色葡萄球菌等多重耐药菌属,极大的提高了金葡菌感染的临床治疗难度和治愈周期,对公共卫生带来沉重压力。寻找新的金葡菌感染治疗靶点和治疗方法已刻不容缓。金黄色葡萄球菌的致病性主要与体内大量的毒力因子表达、释放有关,各类毒力因子帮助金黄色葡萄球菌接近并粘附至宿主表面,进而侵染宿主细胞。这些毒力因子的表达由多种效应因子调控,双组份调控系统是其中非常重要的一类调控因子。双组份调控系统被认为是细菌、低等真核生物以及植物中感应环境变化并做出相应应答的重要信号转导方式。该系统一般由一个具有信号感应能力的组氨酸激酶和一个下游的效应调节因子组成。该系统的运作模式大致为组氨酸激酶接受环境变化刺激信号后,在保守的组氨酸位点发生自磷酸化,接着再将磷酸化基团传递给下游的效应调节因子,从而改变效应调节因子对特定DNA底物的结合亲和力,最终改变特定基因的转录水平。在金黄色葡萄球菌中,由于双组份调控系统直接参与控制金葡菌的各类关键生命活动,因此被视为非常有潜力的新型治疗靶点。ArlR/S是金葡菌双组份调控系统中的一员,其中ArlS为具有信号感应能力的组氨酸激酶,ArlR是其对应的效应调控因子。目前已有的体内实验研究证明该双组份调控系统可以在多种生理过程中发挥作用,包括影响调控分子RNAⅡ、RNAⅢ和自溶素的生成,以及抑制金葡菌的生物被膜形成等等。在这些生理功能中,ArlR蛋白对全局调控因子agr的识别机制及调控机理受到广泛关注,但是由于已有研究仅停留在细胞生物学水平上,其分子机制至今尚不清楚。针对上述科学问题,在本论文的第一部分中,我们就金葡菌ArlR蛋白与全局调控因子agr的识别及调控机制展开了研究。通过体外重组表达,我们分别获得了全长的ArlR蛋白,只含有DNA结合结构域的ArlRDBD蛋白以及模拟磷酸化修饰状态的全长ArlRD52E蛋白。通过EMSA方法研究了 ArlR蛋白及其突变体与agr基因间的相互作用情况,发现ArlRDBD和ArlRD52E可结合agr,而ArlR蛋白只有当浓度相当高的时候才可以结合agr。通过DNaseI酶解足迹法我们找到了ArlR可以特异性识别的两个agr区段,其长度分别为21 bp和31 bp;通过FPA方法,我们测定了三种蛋白样品与这两个特异性识别区段间各自的相互作用参数。采用分子排阻层析、动态光散射和化学交联三种方法,我们发现在溶液中,ArlR蛋白的聚集状态为单体,磷酸化后的ArlRD52E蛋白为二聚体,ArlRDBD蛋白主要为单体。为了阐明上述聚集状态变化与DNA结合能力变化之间的关系,我们解析获得了 2.5 A分辨率的ArlRDBD蛋白晶体结构。通过对该结构的比对分析和一系列突变体实验,我们确认了 ArlRDBD蛋白的DNA结合位点及其对DNA底物的长度偏好性。综合上述结构生物学和生物化学实验结果,我们提出了一种ArlR蛋白调控全局调控因子agr的可能机制。该工作对深入理解双组分系统中磷酸化修饰对蛋白的DNA结合亲和力调节机理具有重要的促进作用。嘧啶二聚体是DNA在太阳光紫外辐射下产生的一种常见的DNA损伤形式。紫外光可以诱导核酸链在相邻碱基的C=C双键附近形成共价连接。在阳光照射下,单个人类皮肤细胞每秒会发生50-100次上述损伤反应,部分未被及时修复的嘧啶二聚体会抑制DNA聚合酶的功能,进而影响基因的转录或者复制,引致突变、染色体异常和细胞凋亡等现象,同时还可能引发黑色素瘤的生成。为了应对紫外辐射所造成的损伤,生物体进化出了多种修复机制。光修复系统就是其中一种重要的DNA损伤修复途径。在低等生物中,光修复酶/隐花色素家族蛋白负责行使上述修复功能。该家族蛋白均为光受体蛋白,可以通过吸收光能,推动电子在FADH-和损伤位点之间的传递,并将嘧啶二聚体还原成正常碱基。光修复酶中通常会结合两个辅因子,分别为催化基团FAD和负责吸收光的发色基团。在本论文的第二部分中,我们通过基因数据分析发现钝节螺旋藻中的一个基因(基因编号NIES39_D05560)可能编码了一种光修复酶,通过对该基因的重组表达和酶活检测,确认该基因编码的Ap-phr蛋白可修复单链和双链DNA中的嘧啶二聚体,并归属于CRY-DASH光修复酶亚家族。通过解析Ap-phr蛋白1.6 A分辨率晶体结构,我们发现该蛋白除催化辅因子FAD以外,还具有吸光发色团MTHF,且相较于同源光修复酶蛋白结构,Ap-phr蛋白中的MTHF结合位置及构象均存在显著差异。上述差异可能会增强Ap-phr蛋白中MTHF到FAD的能量传递速率,有可能是CRY-DASH光修复酶亚家族蛋白在弱光条件下依然能收集积蓄光能的重要原因之一。
【图文】：

双组份,调控系统,信号转导,结构域

更好地应对环境的改变。逡逑尽管双组份调控系统在一些例如酵母、丝状真菌、低等致病菌和低等植存在，但在一些高等的真菌中却没有发现，包括人类中也没有发现相类系统。因此基于对ＴＣＳｓ的特性的充分掌握，它们己经被视为一个很有疗靶点来治疗由一些致病微生物造成的疾病１１９］。逡逑ＨＫ通常含有两个保守的结构域，包含保守组氨酸位点（发磷酸化团转移反应的位点）的二聚化组氨酸磷酸转移结构域（ＤＨｐ）和具有催的ＡＴＰ结合结构域（ＣＡ）。此外，组氨酸激酶在ＤＨｐ的Ｎ末端还含有多个结构域。对于大多数的激酶来说在Ｎ端含有】－１３个不等的跨膜结而信号识别则主要发生在胞质侧或者蛋白的胞外段。尽管ＨＫ含有一些构域，但是胞外的信号识别结构域却相对比较多变。对于许多ＨＫ来说，，结构域和ＤＨｐ结构域之间还含有至少一个结构域，目前比较多见的是Ｐ合血红素或者黄素的结构域），ＨＡＭＰ邋（作为ｌｉｎｋｅｒ的结构域）和ＧＡＦ邋ｃＧＭＰ的结构域）结构域这些结构域可以负责从胞外信号识别结构传递给ＤＨｐ和ＣＡ结构域，或者有一些甚至可以直接识别胞质段的信号［２｜ｓｉｇｎａｌ邋＇逡逑

结合模式,二聚

在目前己经解析的ＲＲ结构中发现ＲＲ的结构比较保守。Ｎ端的ＲＤ通常为（３卜逡逑ａｌ－Ｐ２－ａ２－ｐ３－ａ３－ｐ４－ａ４－ｐ５－ｃｔ５的拓扑结构，并且有一个保守的磷酸化位点在其中逡逑１２３１。ａ４－邋ｐ５－ａ５界面中更是有许多在家族中高度保守的氨基酸残基，实验也证明逡逑了这三个结构元素对于ＲＲ发挥功能是不可或缺的［２４】。ＤＢＤ通常可结合特定的逡逑串联或者反向重复序列来启动调控的功能１１２］。连接ＲＤ和ＤＢＤ的丨ｉｎｋｅｒ区的长逡逑度也通常有所差异，这种差异可能直接与两个结构域的取向相关［２５】。逡逑有将近５０％的ＲＲｓ只含有一个ＤＮＡ结合结构域作为效应结构域，但发现在发逡逑挥功能时ＲＲ经常以二聚体的形式出现，因此认为二聚的出现对于ＲＲ开始发挥逡逑功能起着重要的作用。二聚体的出现也使ＲＲ在发挥作用时存在多个作用面，包逡逑括ＲＤ之间的结合面和ＲＤ与ＤＢＤ之间的结合面。在许多ＲＲ转录因子中发现逡逑磷酸化介导了邋ＲＤ二聚体结合面的形成，同时也发现了四种ＲＤ二聚的模式（见逡逑图１．３）邋［２６］。此外，在对ＫｄｐＥ因子的研究中发现，突变ＲＤ和ＤＢＤ界面中相互逡逑作用的氨基酸残基破坏作用界面会导致蛋白功能的丧失，这直接证明了邋ＲＤ和逡逑ＤＢＤ之间作用面的重要性［２７］。除了结合ＤＮＡ的结合结构域，ＲＲ的信号输出结逡逑构域还可能是甲基转移酶或者双鸟苷酸环化酶。逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378

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