【摘要】：背景:在围术期脑血管疾病患者发生脑血管意外的风险大大增加,容易引起致残、死亡等严重后果,威胁生命安全。在脑血管疾病中,以缺血性脑血管病居多,脑组织缺血恢复灌注后,引起一系列病理生理变化,反而导致损伤进一步加重,即为脑缺血再灌注损伤。及时采取积极有效的措施可以减轻脑缺血再灌注损伤,避免情况进一步恶化。脑缺血再灌注损伤的机制非常复杂,涉及多种因素,并且相互影响。炎症反应是缺血再灌注损伤重要的病理生理改变特征之一,减轻炎症反应是治疗缺血再灌注损伤的有效策略之一。脑缺血后,小胶质细胞迅速活化,活化的小胶质细胞产生大量促炎症因子,导致损伤加重,抑制小胶质细胞活化可以减轻缺血再灌注损伤。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一种高选择性的α_2受体激动剂,具有镇静、镇痛、抗交感兴奋等作用,在临床中应用广泛。大量临床和基础研究结果表明,右美托咪定对脑、肝、肾、脊髓、肺、心等重要器官损伤具有保护作用,可能涉及多种机制,尚不明确。有研究发现右美托咪定可通过抑制小胶质细胞活化减少炎症因子释放减轻脊髓损伤,关于右美托咪定是否可以通过小胶质细胞影响脑缺血再灌注损伤的在体实验研究未见报道,值得进一步研究。目的:本实验通过建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型和小鼠小胶质细胞株BV2细胞氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation and reperfusion,OGD/R)模型,在动物和细胞水平模拟缺血再灌注损伤,从小胶质细胞活化角度,探讨右美托咪定的脑保护作用,以及其可能的机制,为临床应用提供理论依据。方法:采用线栓法建立大鼠MCAO模型。取60只SD雄性大鼠随机分为3组(n=20):假手术组(Sham组)、MCAO模型组(I/R组)和右美托咪定+MCAO组(Dex+I/R组)。再灌注24h后各组同时检测各项指标。采用Longa's评分法评估神经功能情况,HE染色观察梗死侧大脑皮层病理改变,TUNEL染色检测半暗带细胞凋亡情况,组织免疫荧光染色观察半暗带小胶质细胞活化情况,ELISA试剂盒检测大脑梗死侧皮层TNF-α水平。建立小胶质细胞氧糖剥夺/复氧(Oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型。将培养的BV2小胶质细胞分为对照组(Control组)、模型组(OGD/R组)、1μM Dex+OGD/R组、10μM Dex+OGD/R组。于复氧培养24h后检测各项指标。采用ELISA试剂盒检测细胞上清液TNF-α浓度,Western blot检测BV2细胞内CD68、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达情况。结果:1.Dex对MCAO模型大鼠神经功能评分的影响与Sham组比较,I/R组神经功能评分显著增加(P0.01),与I/R组比较,Dex+I/R组神经功能评分降低(P0.05)。2.Dex对MCAO模型大鼠梗死侧皮层脑组织显微结构的影响与Sham组比较,I/R组细胞数量减少,大量细胞坏死,细胞呈空泡样变性,间质水肿疏松,Dex干预后细胞核部分固缩,少量细胞呈空泡样变性,间质水肿减轻。3.Dex对MCAO模型大鼠梗死侧皮层半暗带细胞凋亡的影响与Sham组比较,I/R组大鼠梗死侧皮层半暗带细胞凋亡率显著升高(P0.01),Dex干预后细胞凋亡率较I/R组降低(P0.05)。4.Dex对MCAO模型大鼠梗死侧皮层半暗带小胶质细胞活化和皮层区TNF-α水平的影响与Sham组比较,I/R组大鼠梗侧皮层区呈活化状态的小胶质细胞数明显增多(P0.01),脑组织TNF-α浓度显著升高(P0.01);而与I/R组比较,Dex+I/R组小胶质细胞活化率降低(P0.05),脑组织TNF-α浓度下降(P0.05)。5.Dex对OGD/R BV2细胞活化和分泌TNF-α的影响BV2细胞经OGD/R后,CD68表达明显增加(P0.01),较低浓度(1μM)Dex对OGD/R BV2细胞CD68表达无显著影响,而经10μM Dex处理的OGD/R BV2细胞CD68表达降低(P0.05)。与Control组比较,OGD/R组细胞上清液TNF-α浓度增加(P0.01),与OGD/R组比较,1μM Dex+OGD/R组、10μM Dex+OGD/R组细胞上清液TNF-α浓度均降低(P0.05)。6.Dex对OGD/R BV2细胞NF-κB表达及活化影响与Control组比较,OGD/R组BV2细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65表达增加(P0.01)。与OGD/R组比较,1μM Dex+OGD/R组、10μM Dex+OGD/R组NF-κB p65表达无显著差异(P0.05),10μM Dex+OGD/R组细胞p-NF-κB p65表达减少(P0.05)。结论:右美托咪定通过抑制小胶质细胞活化减轻大鼠脑缺血再灌注损伤发挥脑保护作用,可能与其抑制小胶质细胞NF-κB活化有关。
【图文】：
陆军军医大学硕士学位论文待测标本吸光度代入标准曲线计，采用 SPSS 24.0 统计软件，方用 LSD 检验，方差不齐时行 KruO 模型梗死灶，Sham 组无白色梗死区，
组别 样本数 longa 评分Sham 组 10 0±0I/R 组 10 2.60±0.52aDex+I/R 组 10 1.90±0.57ba：P<0.01，与 Sham 组比较；b：P<0.05，与 I/R 组比较2.2.3 右美托咪定降低脑缺血再灌注大鼠脑组织病理损伤程度在光镜下观察 HE 染色切片标本梗侧大脑皮层病理改变。Sham组：细胞排列有细胞形态结构正常，细胞核圆形，核仁清晰，胞浆均匀淡染，细胞周围间隙致密。组：脑组织着色浅，细胞数量减少，，排列紊乱，大量细胞坏死，细胞胞体缩小，胞固缩或碎裂，细胞呈空泡样变性，间质水肿疏松。Dex+I/R 组：细胞坏死程度较 组减轻，细胞核部分固缩，少量细胞呈空泡样变性，间质水肿减轻，说明右美托咪干预减轻脑缺血再灌注后病理损伤，见图 2。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614;R-332
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