Christensenella minuta全基因组分析及其安全性探索

发布时间：2020-05-27 01:18

【摘要】：肥胖作为一种与糖尿病、心血管疾病、脂肪肝等发生密切相关的慢性代谢性疾病,因其高发病率和高危后果成为全球公共健康问题。因此,如何预防及治疗肥胖已成为研究热点。Christensenella minuta(C.minuta)是一种严格厌氧的革兰氏阴性肠道菌,已有研究表明其与体重减轻密切相关,具有治疗肥胖的潜在应用价值。然而由于C.minuta的遗传背景未知且难以在体外大量培养,制约了对其进行深入研究。因此,本论文通过第二代和第三代测序技术测定C.minuta全基因组序列,重点分析了C.minuta基因组中与安全性相关的遗传信息,探究了C.minuta假定溶血素基因表达产物的溶血活性和其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)毒性,初步阐明了C.minuta的遗传信息和致病相关生理生化特性;针对该菌难培养的特性,对其培养基进行了优化,通过体外培养能够高效获得大量C.minuta活菌。这不仅为C.minuta微生物学研究奠定了基础,还为今后C.minuta益生菌制剂的开发和应用提供了思路。本论文得出的主要结论如下:通过第二代和第三代测序技术测定了C.minuta全基因组序列,其基因组大小为2,969,292 bp,平均GC含量为51.44%,含有3053个基因,67个串联重复序列,36个小卫星序列,9个微卫星序列,49个tRNA,6个rRNA和1个sRNA。对C.minuta基因组中与安全性相关的遗传信息进行分析发现,C.minuta基因组中不含有与病原菌致病性和耐药性相关的基因岛和前噬菌体,含有12个不易转移的耐药基因、10个或许不能成功表达或产物活性极低的有害代谢产物相关基因、1个假定溶血素基因及部分内毒素LPS合成基因。通过大肠肝菌表达系统制备了假定溶血素蛋白,分别检测假定溶血素蛋白及C.minuta菌株溶血活性,发现菌株和蛋白均未在血平板上形成溶血环,说明该假定溶血素基因表达产物无溶血活性,C.minuta也无溶血性。通过SDS-PAGE电泳银染法比较了C.minuta LPS与致病性大肠杆菌LPS的结构,结果发现C.minuta LPS仅显示18 kDa、20-28 kDa和33 kDa三个条带,明显不同于致病性大肠杆菌LPS的典型阶梯状指纹条带结构。随后体外细胞试验结果表明,与致病性大肠杆菌LPS相比,C.minuta LPS不能有效激活RAW 264.7巨噬细胞,诱导细胞增殖和吞噬、核转录因子NF-κB活化以及炎症介质(TNF-α、IL-6、IL-1β、NO和活性氧)合成的能力很低,因此认为C.minuta LPS毒性弱甚至无毒。通过单因素试验法和响应面法对PYG(peptone-yeast extract-glucose)培养基进行优化,获得C.minuta菌体生长的最佳培养基:果糖5.41 g/L,牛肉提取物63.21 g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.90 g/L,MgSO_4 0.032 g/L,K_2HPO_4 0.16 g/L,NaHCO_3 1.6 g/L。C.minuta在此优化培养基中培养时,活菌数可达8.15×10~(10) cfu/mL,比PYG培养基的活菌数提高48.22倍。
【图文】：

电泳图,基因组DNA,电泳,基因组

图 2-1 C. minuta 基因组 DNA 电泳结果 DNAMarker；1-12：C. minuta 基因组 DNA；M2：1 Fig. 2-1 The electrophoresis of C. minuta genomic DNt DNAMarker; 1-12: C. minuta genomic DNA; M2: 1 kb C. minuta 基因组样品（图 2-1）进行 Qubit Fl别为 256 ng/μL、278 ng/μL，两份样品总量为 3时用NanoDrop分光光度计检测得出OD260/OD 2.07、2.05，表明样品未有 RNA、蛋白质或酚文库构建和测序。基因组基本特征和 Illumina Hiseq 2500 测序数据进行组装，获

耐药性,毒力因子,水平基因转移,抗生素耐药

华南理工大学硕士学位论文噬菌体；具体信息见表 2-2。基因岛和前噬菌体是由水平基因转移形成的一段具有特定功能的 DNA 片段，众多致病菌的毒力因子和耐药性基本由其产生。如化脓链球菌 M1T1 含有能编码 SpeA2 和Sad1 两种毒力因子的前噬菌体，，增强了 M1T1 菌株的适应性和毒性[58]；沙门氏菌的 1型基因岛可介导对氨苄西林、链霉素、氯霉素、四环素和磺胺类药物等多种抗生素耐药，使菌株的耐药谱加宽、耐药性增强[59]。C. minuta 不含有这两种基因组件，说明该菌的致病性或耐药性可能较弱。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R371

【参考文献】