Ach在NE介导C2C12细胞分化中的作用和机制

发布时间：2020-05-26 20:00

【摘要】：研究背景:骨骼肌是人体健康的基础,也是人体体力活动和运动能力的保障。肌肉萎缩一直困绕人类健康的难题,骨骼肌的萎缩不仅给患者本身的治疗带来麻烦,还会给社会带来沉重的负担。既往研究证实:骨骼肌的萎缩与失神经、营养不良、废用以及恶病质如:癌症、糖尿病、年龄老化、肾病、心力衰竭和慢性阻塞性肺病(COPD)、败血症、重度烧伤等有关。通过对糖尿病病人的骨骼肌萎缩进一步研究发现:交感神经调节的异常可引起糖尿病,同时糖尿病又常伴有交感神经损害。这些结果暗示:交感神经调节的异常可能与骨骼肌的萎缩也有关系。但是相关方面的研究却很少。但实际上,骨骼肌本身,除了受运动神经支配外,骨骼肌血管还受交感舒血管神经支配,而在交感舒血管神经兴奋时,发挥生物学效应的主要神经递质是乙酰胆碱。但乙酰胆碱是否参与了骨骼肌干细胞增殖、分化过程,从而影响骨骼肌的自我更新或修复,尚不明确。研究目的:探索乙酰胆碱在骨骼肌干细胞分化中作用及其与去甲肾上腺素调节骨骼肌干细胞分化的关联机制。研究方法:以小鼠C2C12细胞为实验材料,建立2%马血清培养基诱导其分化形成肌管,利用免疫荧光、RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质印迹法检测正常C2C12细胞毒蕈碱样型受体(m AchRs)不同亚型的表达情况;采用CCK8法评价不同浓度乙酰胆碱对C2C12细胞增殖的影响;利用免疫荧光及QPCR法检测C2C12细胞分化为快肌和慢肌的肌纤维类型以及相关的肌细胞生成蛋白(Myogenin,Myog)、生肌调节因子Myod和Myf5等调控因子的表达;利用Ach,或Kpc1过表达/敲低的腺病毒转染C2C12细胞,采用上述类似方法和指标观察其在去甲肾上腺素介导的C2C12细胞分化中的作用。研究结果:(1).免疫荧光、QPCR和蛋白质印迹法结果显示:M1,M2,M3,M4,M5等mAchRs亚型在C2C12细胞均有表达,且M2-AchR表达量最高,M3-AchR表达量最低。(2).CCK8结果显示:不同浓度梯度的乙酰胆碱对C2C12细胞增殖无明显影响。QPCR和免疫荧光结果显示:低浓度乙酰胆碱对C2C12细胞分化有促进作用,但高浓度的乙酰胆碱能够抑制C2C12细胞分化。QPCR和免疫荧光结果显示:低浓度乙酰胆碱对C2C12细胞纤维类型的改变无明显影响,但高浓度的乙酰胆碱能抑制C2C12细胞快肌纤维和慢肌纤维的形成。(3).光镜及QPCR和免疫荧光染色发现:与对照组相比,Ach组和NE组肌管形成的量均有所减少,但NE组减少的更加明显;Ach联合NE组肌管虽与对照组相比也发生了减少,但比单一的Ach组或NE组要高;与对照组相比,单一的Ach组或者NE组,快慢肌纤维均有一定程度的减少,但以慢肌纤维的减少最为明显,NE组慢肌纤维减少的程度大于Ach组,Ach联合NE组与对照组相比,快慢肌纤维也有所减少,但比NE组要高。(4).光镜下发现:Ad-Kpc1组肌管分化与对照组相比有所增加,而Ad-shKpc1组与对照组相比有所减少,Ad-Kpc1+NE组与NE组相比有所增加。而Ad-shKpc1+NE组与NE组相比有所减少,但并不显著;QPCR和免疫荧光染色显示:Ad-Kpc1组快慢肌纤维与对照组相比均有所增加,且以慢肌纤维增加为主,而Ad-shKpc1组快慢肌纤维与对照组相比均有所减少,也以慢肌纤维减少为主。Ad-Kpc1+NE组与NE组相比快慢肌纤维均有所增加,而Ad-shKpc1+NE组与NE组相比快慢肌纤维均有所减少,且慢肌纤维减少的程度比快肌纤维更显著。研究结论:(1).Ach低浓度时主要通过与C2C12细胞上M2受体结合而利于C2C12细胞分化,但在Ach高浓度时抑制了C2C12细胞分化,且以慢肌纤维减少最为明显;(2).NE抑制了C2C12细胞分化,快慢肌纤维均减少,且以慢肌纤维减少最为明显;(3).Ach能部分逆转NE所介导的C2C12细胞分化抑制效应;(4).Kpc1能促进C2C12细胞分化,并有效取消了NE所介导的C2C12细胞分化抑制效应。
【图文】：

细胞,免疫荧光,光镜,马血清

结果2C12 细胞培养及免疫荧光鉴定传至第三代后，在光镜下观察 C2C12 细胞在增殖期的形态(见用含有 2%马血清的分化培养基，，进行 C2C12 细胞的诱导分化后，经光镜下观察发现，可见 C2C12 细胞已经形成典型的肌随后对 C2C12 细胞分化的标志物 MYH 和 Myog 进行免疫荧光12 细胞呈现明显肌管形成和 MYH 和 Myog 强阳性表达，进细胞已分化为肌细胞(见图 1.1C 和图 1.1D)。

细胞,免疫荧光,光镜,马血清

结果2C12 细胞培养及免疫荧光鉴定传至第三代后，在光镜下观察 C2C12 细胞在增殖期的形态(见用含有 2%马血清的分化培养基，进行 C2C12 细胞的诱导分化后，经光镜下观察发现，可见 C2C12 细胞已经形成典型的肌随后对 C2C12 细胞分化的标志物 MYH 和 Myog 进行免疫荧光12 细胞呈现明显肌管形成和 MYH 和 Myog 强阳性表达，进细胞已分化为肌细胞(见图 1.1C 和图 1.1D)。
【学位授予单位】：湖北医药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】