人诱导多能干细胞的构建及向血管平滑肌细胞诱导分化的实验研究

发布时间：2020-05-28 05:13

【摘要】：目的:构建源自人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs),并鉴定构建的细胞,为后期建立心血管疾病的诱导多能干细胞库奠定基础。通过单层细胞分化法将iPSCs分化为血管平滑肌细胞(Vascular smooth cells,VSMCs),观察分化过程中的相关变化,并对分化的细胞进行鉴定,确保可靠性,为后续研究提供充足的研究材料。方法:分离PBMCs,并使用非整合质粒电转的方式构建成iPSCs。通过光镜下观察细胞形态、碱性磷酸酶染色(Alkaline phosphatase,AP)、细胞免疫荧光染色和体内三胚层分化实验四种方法鉴定构建的iPSCs。采用单层细胞法将诱导多能干细胞诱导分化为血管平滑肌细胞,并采用光镜下观察细胞形态、钙黄绿素染色、细胞免疫荧光染色、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR)方法鉴定分化出来的VSMCs。结果:1.成功分离并培养出PBMCs,采用非整合质粒电转的方法将PBMCs向iPSCs诱导。光镜下,iPSCs呈现出与胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)类似的克隆样生长方式,呈大的圆形或椭圆形样,边缘整齐,细胞排列紧密;高倍镜下细胞核大而圆,有一个至多个细胞核,胞浆较少。AP染色显示诱导的多能干细胞呈强阳性,表现为克隆中出现紫黑色颗粒。细胞免疫荧光检测结果显示所有iPSCs中Nanog,Sox2,Oct4,TRA-1-60均为强阳性。体内三胚层分化实验证实iPSCs可以向三个胚层的细胞成分分化,明确表明其具有多能性。2.对分化出来的iPSCs-VSMCs,在光镜下可见细胞形态呈梭形,多角形,并对分化出来维持培养的细胞进行钙黄绿素染色证明细胞存活。通过Q-PCR检测构建的iPSCs及iPSCs-VSMCs,iPSCs-VSMCs中α-SMA,CNN1,SM22α的mRNA水平显著升高。进行免疫荧光染色显示分化出来的细胞在蛋白水平表达特异性标记α-SMA,CNN1,SM22α。结论:由PBMCs进行非整合质粒电转的方式成功构建了iPSCs,其具有ESCs类似的生长方式,表达多潜能标记并在体内具向三个胚层的细胞分化潜能。单层细胞分化法是iPSCs向VSMCs分化的可靠方法,分化出的细胞长期存活并与具有VSMCs相同的细胞形态,表现出特异性标记高表达。为组织工程血管构建、再生医学研究、疾病模型构建、药物筛选等研究奠定了基础。
【图文】：

遵义医科大学硕士学位论文 郎正鹏2.结果2.1.iPSCs 的鉴定2.1.1 光镜下观察 iPSCs 的形态在 Matrigel 包被的培养皿中，，用 mTeSRTM1 维持培养的 iPSCs 呈现出与 ESCs 类似的克隆样生长方式，克隆呈圆形或椭圆形，边缘整齐，克隆内部细胞排列紧密，克隆边缘细胞稍疏松，表明细胞处于快速增殖状态。如图 1 所示

遵义医科大学硕士学位论文 郎正鹏2.1.2 碱性磷酸酶染色（Alkaline phosphatase，AP）AP 是原始未分化细胞的重要标志之一，在胚胎干细胞中活性较高，目前也用于鉴定 iPSCs 具有干细胞特性的标记。如图 2 所示，患者 PBMCs 诱导产生的 iPSCs 中 AP染色呈强阳性，表现为 iPSCs 克隆中出现紫色颗粒。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

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