旋毛虫组织蛋白酶B的克隆表达及在幼虫侵入小鼠肠上皮细胞中的作用

发布时间：2020-05-30 11:14

【摘要】：旋毛虫病是一种食源性人兽共患寄生虫病,主要是由于生食或半生食含囊包幼虫的肉类所致。旋毛虫可引起发热、面部水肿、肌肉疼痛等多种临床表现,严重感染可因并发症而死亡。幼虫是旋毛虫的主要致病阶段,寻找幼虫在侵入肠黏膜过程中起到关键作用的蛋白酶尤为重要,组织蛋白酶B是木瓜蛋白酶样的半胱氨酸蛋白酶,前期研究发现组织蛋白酶B能够降解宿主的黏连蛋白、纤连蛋白、Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白,与寄生虫的侵入与组织内移行有关,由此我们推测该蛋白可能参与了旋毛虫入侵宿主。本研究克隆表达了旋毛虫组织蛋白酶B(TsCB),并对其生物信息学性质进行了分析,利用纯化后的重组TsCB(rTsCB)制备免疫血清,然后对TsCB进行免疫荧光定位、RT-PCR分析,并研究其与小鼠肠上皮细胞(IECs)的结合作用以及在侵入IECs中的功能,从而探究TsCB在旋毛虫入侵宿主IECs的作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物、细胞及菌株本实验所用旋毛虫虫种为河南南阳猪源地理株,实验动物包括昆明小鼠、BABL/c小鼠,均购自河南省实验动物中心,细胞为本实验分离传代得到的小鼠IECs,rTsCB表达菌株为BL21。2.TsCB生物信息学分析利用ExPasy网站对TsCB蛋白的基本理化性质进行预测分析;在SignalP 4.1 Server预测TsCB是否具有信号肽;在TMHMM网站预测TsCB蛋白跨膜结构;利用SWISS-MODEL网页预测TsCB的二级结构和三级结构;在NCBI中找到TsCB(Tsp-03306)相关信息,预测其酶活性位点。使用BioEdit软件,将旋毛虫组织蛋白酶B与人、小鼠和其他寄生虫的组织蛋白酶B进行序列比对和系统发育进化树分析。3.TsCB的克隆表达及抗原性分析将TsCB基因连接到表达载体pQE-80L,原核表达出重组蛋白rTsCB,经镍柱亲和纯化后免疫小鼠制备小鼠抗rTsCB免疫血清,并收集ML粗抗原和ES抗原,进行SDS-PAGE和Western blot实验,分析rTsCB的抗原性。4.TsCB在旋毛虫各虫期的表达及荧光免疫定位通过RT-PCR分析TsCB基因在不同虫期[肌幼虫(ML)、肠道感染性幼虫(IIL)、成虫(AW)、新生幼虫(NBL)]的转录水平,收集不同虫期的虫体,将新鲜虫体制成石蜡切片,进行IFA实验检测TsCB在旋毛虫不同发育阶段的表达及定位情况。5.TsCB与IECs的结合作用及其在旋毛虫侵入IECs中的作用通过ELISA、Western blot、Far-Western和荧光共聚焦显微镜检查,将TsCB与IECs孵育后检测两者结合情况,并通过分离的IECs胞浆与胞核,进一步验证TsCB和IECs的相互作用。然后进行体外幼虫侵入实验,将IIL幼虫加入DMEM半固体培养基中,覆盖于IECs单层表面,在培养基中同时分别加入rTsCB和rTsCB免疫血清,孵育2h后镜下观察幼虫对IECs的侵入。6.干扰TsCB基因的表达对IIL侵入IEC的阻断作用设计小干扰RNA(siRNA 596),沉默TsCB在肌幼虫的表达,确定siRNA 596干扰的最佳浓度和持续时间,将干扰后的ML进行体外侵入实验,观察沉默TsCB基因的表达对幼虫侵入IEC的阻断作用。7.rTsCB免疫小鼠诱导的免疫应答和免疫保护作用将30只BALB/c小鼠(雌性)随机分成3组即rTsCB免疫组、佐剂组和PBS组,按每只小鼠20μg rTsCB蛋白皮下多点注射,间隔2周免疫,共免疫4次,末次免疫后每只小鼠经口感染300条ML,感染6d后,剖杀小鼠,收集肠道中的成虫及培养后的新生幼虫,计算成虫减虫率及新生幼虫产量,并对虫体体长进行测量,观察形态变化。8.统计学处理使用SPSS17.0统计软件对本实验中所有数据进行处理分析,数据采用均数±标准差,根据实验及数据的类型选择统计学方法,包括卡方检验、单因素方差分析和t检验,检验水平为α0.05。结果1.TsCB生物信息学分析TsCB(accession No:NW_003526941.1)基因的生物信息学软件及在线网站分析预测结果显示,TsCB基因序列全长1071bp,编码356个氨基酸,分子量约为40.23kDa,等电点为7.86。具有信号肽(1-29aa),N端有明显的疏水区,有1个跨膜区(12-35aa),存在有1个肽酶(peptidase_C1A)的结构功能域,位于102-351aa,定位于细胞膜外。TsCB二级结构包含有7个α-螺旋、13个β-折叠,三级结构预测有4个酶活性位点分别为:组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn),他们紧密排布于该蛋白分子空间结构中。2.TsCB的克隆表达及抗原性分析将TsCB基因连接到克隆载体pMD19-T中,双酶切后将TsCB连接到表达载体pQE-80L,构建重组表达质粒pQE-80L/TsCB,转入感受态细胞中,将阳性克隆菌进行测序鉴定,将连接成功的单菌落加2 mM IPTG,37℃诱导6h后收集菌体进行SDS-PAGE,发现pQE-80L/TsCB在39.7kDa处出现一条蛋白带,可溶性分析显示rTsCB以包涵体形式存在,将rTsCB免疫小鼠制备鼠抗rTsCB血清。Western blot分析显示,纯化后的rTsCB蛋白可被抗rTsCB血清识别,但不能被旋毛虫感染小鼠血清识别,与正常小鼠血清无交叉反应;抗rTsCB血清可识别旋毛虫不同期虫体(ML,IIL,AW,NBL)粗抗原中天然的TsCB,但不能识别ES抗原中的TsCB,表明TsCB是旋毛虫虫体蛋白中的成份。3.TsCB在旋毛虫各虫期的表达及荧光免疫定位RT-PCR结果表明TsCB基因在旋毛虫不同期虫体(ML,IIL,AW,NBL)均有转录,虫体切片免疫荧光显示TsCB主要定位于虫体杆状体、皮层和雌成虫的胚胎。4.间接ELISA检测rTsCB与IECs的结合用不同浓度IECs包板,与10μg/mL rTsCB孵育后,ELISA结果表明IECs蛋白最佳包被浓度为3.2μg/mL。然后以此浓度包板,与不同浓度的rTsCB蛋白孵育,结果表明rTsCB浓度达到1.75μg/mL时,rTsCB与IEC蛋白充分结合。OD值随着IEC包被浓度的增加而升高(F=298.187,P0.01),两者具有相关性(r=0.743,P0.05);此外,OD值也随着rTsCB孵育浓度的加大而增加(F=458.891,P0.01),二者也具有显著相关性(r=0.953,P0.01),表明重组蛋白可以和IECs结合。5.Western blot分析rTsCB与IECs的特异性结合rTsCB与活的IECs孵育2h后,Western blot实验显示抗rTsCB免疫血清识别了7条IECs的蛋白带,而感染血清识别了5条带,正常血清不能识别。然而,抗rTsCB血清不能识别经BSA孵育后的IECs蛋白。将IECs胞浆蛋白和胞核蛋白分别与rTsCB孵育后进行的Western blot结果显示,抗rTsCB血清分别识别5条胞浆蛋白带和3条胞核蛋白带,表明TsCB与IECs的结合位点是在IEC胞浆与胞核。6.Far western和IFA验证rTsCB与IECs相互作用Far-Western结果显示IECs蛋白能被抗rTsCB血清和旋毛虫感染小鼠血清识别,但不能被正常小鼠血清识别;抗rTsCB血清能识别IEC全细胞蛋白中的8条带,胞浆蛋白中的7条和胞核蛋白中6条带,再次表明rTsCB能够与IECs结合,共聚焦显微镜检查发现,rTsCB能够与IECs特异性结合,更加直观形象的表明rTsCB能够与IEC结合,结合部位在的IECs的胞浆与胞核。7.rTsCB与抗rTsCB血清对旋毛虫体外侵入IECs的促进与抑制作用体外侵入结果表明,rTsCB对IIL幼虫侵入IECs有显著地促进作用,这种促进作用呈剂量依赖性(r=0.985,P0.01),且随着抗rTsCB蛋白浓度的增加,促进侵入作用增强(F=341.596,P0.01),但BSA并无促进幼虫入侵作用。将IIL加入IECs单层后幼虫能够侵入细胞单层。与PBS组相比较,抗rTsCB血清(1:100-1:600)能够明显抑制幼虫的对IECs侵袭(P0.01)。抗rTsCB抗体的抑制作用呈剂量依赖性(r=0.974,P0.01),随着血清稀释度的增加呈下降趋势(F=90.963,P0.01)。此外,小鼠免疫前血清和单佐剂免疫小鼠血清对幼虫入侵无明显的抑制作用。8.沉默TsCB基因对IIL侵入IECs的阻断作用利用电穿孔法将不同终浓度的siRNA 596转染旋毛虫肌幼虫,进行Western blot实验,结果表明在siRNA 596浓度为1μM、1.5μM、2μM和2.5μM时,TsCB表达量分别被抑制了19.61%、41.35%、75.47%及72.38%。,因此siRNA 596浓度为2μM时的干扰效果最好。将2μM siRNA 596导入虫体培养2天后TsCB蛋白表达量被抑制了89.49%。体外侵入实验结果显示,siRNA 596干扰组与PBS组相比,两组幼虫侵入率的差异有统计学意义(χ2=42.632,P0.01),沉默TsCB基因对幼虫侵入IEC抑制率为49.96%。9.rTsCB诱导的免疫应答类型及免疫保护作用分析rTsCB免疫小鼠后,血清中IgG抗体明显升高,在第2次免疫后,IgG1及IgG2a水平也明显升高,但IgG1升高水平更为显著(t_(4w)=4.350,t_(6w)=4.247,t_(8w)=2.902,P0.01),因而rTsCB免疫小鼠主要诱导的是Th2型免疫反应。rTsCB免疫小鼠攻虫感染后6d,成虫的减虫率为52.81%,与PBS组相比差异显著(F=63.80,P0.01),佐剂组与PBS组成虫数差异无统计学意义(F=8.4,P0.05)。对雌、雄成虫的体长分别进行测量,结果表明与PBS组和佐剂组相比,rTsCB免疫组雌成虫体长明显变短(F=19.390,P0.01),而雄成虫体长变化3组间无明显差异(F=1.849,P0.05)。此外,rTsCB免疫组新生幼虫产量与PBS组相比,明显减少(F=11.153,P0.01),对新生幼虫体长进行测量发现,rTsCB免疫组新生幼虫体长变短,与PBS组差异显著。(F=24.788,P0.01)。结论1.成功构建了旋毛虫组织蛋白酶B(TsCB)重组原核表达质粒PQE-80L/TsCB,并诱导表达出rTsCB;2.TsCB在旋毛虫各个发育时期均有表达,主要定位于虫体杆状体、皮层和雌虫的胚胎;3.rTsCB能够与小鼠肠上皮细胞特异性结合,对旋毛虫侵入肠上皮细胞有明显的促进作用,而抗rTsCB血清能够显著抑制幼虫对肠上皮细胞的侵入;沉默TsCB基因亦明显抑制了旋毛虫对小肠上皮细胞的侵入;rTsCB对小鼠具有较好的免疫保护作用。因此,TsCB是旋毛虫侵入宿主肠上皮细胞的相关蛋白。
【图文】：

疫保护作用性 BABL/c 小鼠进行攻虫感染，每只小鼠灌胃 3后的新生幼虫，并对其进行体长测量和计数，，结息学分析化性质和结构功能分析 旋毛虫组织蛋白酶 B（c软件及在线网站分析预测结果显示，TsCB 基序列全长 1071bp，编码 356 个氨基酸，分子量约号肽，位于 1-29aa（图 1），N 端有明显的疏水区有 1 个肽酶（peptidase_C1A）的结构功能域（图 4蛋白可能为分泌蛋白（图 5）。二级结构包含有 7）（图 6、图 7-a），三级结构预测有 4 个酶活性位点氨酰胺（Gln）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（Asn构中。

个肽酶（peptidase_C1A）的结构功能域（图可能为分泌蛋白（图 5）。二级结构包含有图 6、图 7-a），三级结构预测有 4 个酶活性胺（Gln）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（。图 1 TsCB 信号肽预测TsCB 蛋白具有信号肽，位于 1-29aa 之间
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R383.15

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本文编号：2688049