Hippo信号通路核心因子LATS2和YAP的互作组学筛选和验证

发布时间：2020-06-02 02:31

【摘要】：背景:Hippo信号通路是协调机体内细胞增殖和分化,控制器官大小和组织再生的信号通路。核心激酶large tumor suppressor 1/2(LATS1/2)和mammalian Sterile 20-like kinases 1/2(MST1/2)被上游信号激活后,抑制转录共激活因子yes-associated protein(YAP)/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif(TAZ)入核,进而负向调控器官发育与再生。除了参与控制器官大小和组织再生外,Hippo信号通路在干细胞及祖细胞自我更新、代谢、免疫和肿瘤的发生发展等生物学过程中也发挥重要作用。LATS1/2是否磷酸化YAP是Hippo信号通路激活与关闭的关键环节,但LATS1/2作为抑癌基因,对其独立于YAP发挥功能的研究较少。肝脏是人体最大的代谢器官之一,而Hippo信号通路对肝癌和肝脏的再生等都有很重要的作用,但是Hippo信号通路和代谢的相关研究较之其他调控领域更少。因此,本论文将肝脏组织mRNA构建成酵母菌株文库,通过酵母双杂交技术(Yeast Two-Hybrid Systems,Y2H)筛选肝脏中与LATS2互作的蛋白并进一步研究其功能。YAP作为Hippo信号通路发挥作用的下游效应分子,对Hippo信号通路行使功能必不可少,虽然已有相关研究鉴定出影响YAP活性的直接或间接调控因子(AMOT,VGLL4和BRD4),但是关于YAP的生物学功能仍然存在一些问题尚待解决,例如YAP如何结合表观因子,YAP的C端转录激活域如何发挥功能等。为了系统解决这些问题,本课题利用BioID(proximity-dependent biotin identification)方法筛选YAP潜在的互作蛋白。该方法主要基于一种改造的生物素连接酶BirA*,它能将邻近蛋白进行生物素化标记,通过链霉亲和素珠子将生物素标记的蛋白进行富集,被生物素化的蛋白通过质谱分析,可初步鉴定出YAP邻近的蛋白和潜在的互作蛋白。目的:分别利用酵母双杂交和BioID蛋白互作组学方法,寻找和Hippo信号通路核心因子LATS2和YAP互作的蛋白,并进一步进行功能验证和分析,为研究Hippo信号通路的调控和病理学功能提供依据。方法:选取LATS1/2蛋白中的LATS2,将它的相关结构域与Gal4的DNA结合结构域构建成融合质粒,通过免疫印迹检测蛋白表达。对融合质粒进行自激活和毒性测试,确认可以进行酵母双杂交筛选后,将表达融合质粒的菌株与肝脏组织的酵母菌株文库共同孵育,筛选肝脏组织中与LATS2互作的蛋白,通过报告基因(His3、LacZ和Leu2)的表达筛选出阳性克隆并利用测序比对筛选正确整合表达的蛋白,将选择的候选蛋白与HA标签融合表达,LATS2与Flag标签融合表达,共转染293T细胞,通过免疫共沉淀检测候选蛋白和LATS2的互作。YAP作为转录共激活因子,在酵母双杂交系统中存在自激活现象。因此,采用BioID方法来筛选YAP的互作蛋白。将结果进行聚类、通路和功能分析,从中挑选40个候选基因,每个基因设计两条特异性的shRNA,利用TBS-Luciferase双荧光报告系统检测候选基因敲低对YAP活性的影响,实时荧光定量PCR(qPCR)检测候选基因敲低对Hippo信号通路下游靶基因表达的影响。结果:通过酵母双杂交筛选到肝脏组织中与LATS2互作的蛋白有22种(PARP9、FGA、SERPINF1、PLOD1、RBP4、AZGP1、AOX1、MST122、MST127、HPX、ATP synthase6、CP、EF1a、WDR6、POLR1B、HPN、NOL11、ZNF350、PSAP、FGB、NR2F6、ALDH2),选择PARP9、WDR6、NOL11、AZGP1、ZNF350、HPX、ALDH2、AOX1作为候选蛋白进行酵母双杂交回复验证,并用磷酸化预测工具(http://www.phosphonet.ca/default.aspx)预测它们是否可以被LATS1/2磷酸化以及磷酸化的位点。根据回复验证和磷酸化位点预测的结果选择PARP9、WDR6、NOL11、ALDH2、AOX1进行互作验证,免疫共沉淀结果显示:ALDH2(Aldehyde dehydrogenase,mitochondrial)和LATS2存在较强的相互作用,已知ALDH2参与酒精代谢,且酒精中毒与ALDH2密切相关。这提示我们:LATS2可能参与ALDH2调节的酒精代谢。通过BioID技术筛选到293T细胞中与YAP邻近的蛋白有1000多种,经聚类、通路和功能分析,发现有机械张力、细胞骨架、转录调节、表观遗传等相关基因可能参与调控YAP,其中已知的有NEDD4、CBLC、HSP90AB2P、CDK2、LATS、MST和AMOT,未知的有WDR26、STRAP、TRIM25、RANBP2、TFG、KHSRP、TES、SEPT7等。与KEGG收录的Hippo信号通路成员和Biogrid收录的与YAP1互作的蛋白进行比对后,选择40个基因作为候选基因,通过TBS-Luciferase双荧光报告系统和qPCR分别检测候选基因敲低对YAP活性和Hippo信号通路下游靶基因的影响,结果显示:PRDX6、TPD52、TRIM25和TRIM33的敲低抑制YAP的活性及其靶基因的转录。结论:LATS1/2可能参与ALDH2调控的酒精代谢;利用BioID方法筛选出多个YAP的调节因子如COR1B、TRIM25、TRIM33等。这提示还有更多机械张力、细胞骨架、转录调节、表观遗传等相关基因可能参与调控YAP的活性。
【图文】：

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图 1. Hippo 信号通路示意图LATS2作为Hippo信号通路核心激酶中的一员，在组织器官发育中发挥重要作用。LATS2 是 AGC 家族的 Ser/Thr 激酶，C-端是高度保守的激酶结构域，N-端有一个 PPxY（P：脯氨酸；x：任意氨基酸；Y：酪氨酸）基序和一个 UBA 结构域（ubiquitin associateddomain），PPxY 基序可以和有 WW 结构域的蛋白结合（如：YAP 和 TAZ），在 N-端还有一个可以和蛋白质互作的结构：脯氨酸-丙氨酸 7 次交替重复（PAPArepeat），，每个结构都可在机体内参与特定的生命过程[7]（图 2）。在哺乳动物各组织器官中LATS2 广泛表达，但表达量存在差异，在人心脏和骨骼肌中的表达高于其它组织[9-11]。LATS2 参与细胞增殖、转录调控、组织器官发育和肿瘤发生等过程[12-14]。

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图 1. Hippo 信号通路示意图LATS2作为Hippo信号通路核心激酶中的一员，在组织器官发育中发挥重要S2 是 AGC 家族的 Ser/Thr 激酶，C-端是高度保守的激酶结构域，N-端有一个：脯氨酸；x：任意氨基酸；Y：酪氨酸）基序和一个 UBA 结构域（ubiquitin assoain），PPxY 基序可以和有 WW 结构域的蛋白结合（如：YAP 和 TAZ），有一个可以和蛋白质互作的结构：脯氨酸-丙氨酸 7 次交替重复（PAPArepe结构都可在机体内参与特定的生命过程[7]（图 2）。在哺乳动物各组织器S2 广泛表达，但表达量存在差异，在人心脏和骨骼肌中的表达高于其它组织S2 参与细胞增殖、转录调控、组织器官发育和肿瘤发生等过程[12-14]。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R346

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