人羊膜间充质干细胞的特征及对2型糖尿病小鼠模型的治疗作用

发布时间：2020-06-01 23:22

【摘要】：背景和目的:糖尿病是位列心血管疾病和肿瘤之后的第三大严重危害人类健康的疾病,主要分为胰岛素分泌缺陷的1型糖尿病和胰岛素作用缺陷的2型糖尿病(Type 2diabetes,T2D)。目前临床上对T2D的治疗主要为使用口服降糖药物或注射外源性胰岛素,如果患者的高血糖没有得到有效控制,则可导致进行性的胰岛β细胞损伤和糖尿病性肾衰、心脏病变、眼底病变、坏疽等并发症。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我复制和多向分化潜能的多能干细胞,具有免疫调节、抑制炎症等特点。近年来,应用MSCs治疗T2D及其并发症已成为糖尿病治疗领域的研究热点。与其他来源(如脐带、骨髓、脐血等)的MSCs相比,人羊膜来源的MSCs(即人羊膜间充质干细胞,Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)具有来源丰富、分离简单、增殖能力强、无致瘤性,低免疫原性及高组织相容性等优点。本课题旨在系统研究hAMSCs的特征以及hAMSCs对T2D小鼠模型的治疗作用及其可能的分子机制,以期为临床上T2D的治疗提供新的方法和手段。方法:1.hAMSCs的分离、培养及鉴定:1)将羊膜从胎盘上分离,依次经胰酶及胶原酶消化得到hAMSCs单细胞悬液;2)将分离得到的hAMSCs接种在10cm培养皿中进行常规培养;3)采用RT-PCR、流式细胞术及免疫荧光检测hAMSCs间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞及免疫源性等相关分子标志物表达;4)体外诱导hAMSCs成骨、成脂分化检测其多向分化潜能。2.hAMSCs致瘤性检测:1)体外将hAMSCs接种在双层软琼脂上,观察其集落形成情况,验证其体外致瘤性;2)体内将hAMSCs接种于NOD/SCID小鼠皮下及肌肉,检测其体内致瘤性。3.hAMSCs体内移植改善T2D小鼠高血糖症状:1)利用高脂喂养联合STZ注射构建T2D小鼠模型;2)将hAMSCs(实验组)或PBS(对照组)经尾静脉注射进入T2D小鼠体内,系统检测实验组和对照组小鼠随机血糖、空腹血糖、糖耐量、胰岛素耐量及血清中C-肽含量的变化;3)通过HE染色及免疫荧光染色检测实验组和对照组小鼠胰腺中胰岛β细胞的形态及数目变化。4.hAMSCs体内移植改善T2D小鼠高血糖症状的相关机制研究:1)通过HE染色检测实验组和对照组小鼠肝脏的形态及结构;2)PAS染色检测hAMSCs对T2D小鼠肝脏组织糖原合成的影响;3)Q-PCR检测hAMSCs对T2D小鼠肝脏糖酵解、糖异生的影响;4)Western Blot检测hAMSCs改善T2D小鼠肝脏胰岛素抵抗的相关信号通路蛋白的表达水平变化。结果:1.成功从人羊膜上分离、培养得到hAMSCs,RT-PCR、流式细胞术及免疫荧光检测表明hAMSCs高表达胚胎干细胞标志基因Nanog、OCT4、SSEA-4及间充质干细胞标志基因CD29、CD73、CD90、CD105。不表达造血干细胞标志基因CD34、CD45、CD133。低表达主要组织相容性Ⅰ类抗原HLA-ABC,不表达其共刺激分子CD80、CD86、CD40,不表达主要组织相容性Ⅱ类抗原HLADR。体外诱导实验表明hAMSCs可成功分化为脂肪细胞及骨细胞,具有多分化潜能。2.体外双层软琼脂实验及体内成瘤实验表明hAMSCs在体外及体内均无致瘤性;3.经尾静脉将hAMSCs移植进入T2D小鼠体内可显著降低小鼠随机及空腹血糖、改善其糖耐量及胰岛素耐量,且可部分重建T2D小鼠胰岛形态;4.进一步研究表明hAMSCs体内移植后小鼠肝脏组织中肝损伤得到改善、糖原合成增加,糖异生相关基因PGC-1α、G6Pase表达下降,糖酵解相关基因LPK、PFK表达上升。另外,炎症相关基因IL-1β、TNF-α表达显著降低。Western Blot检测表明,hAMSCs体内移植可显著提高T2D小鼠肝脏组织中胰岛素敏感性相关蛋白p-IRS-1、GLUT4的表达,IGF-1R、p-IGF-1R、PI3K、AKT、p-AKT等表达也显著上调。结论:hAMSCs表达间充质干细胞及胚胎干细胞标志蛋白,具有分化潜能高、免疫原性低及安全无致瘤性等特点。hAMSCs体内移植可降低T2D小鼠血糖,改善STZ及长期高糖引起的胰岛损伤,降低T2D小鼠肝脏组织炎症水平、抑制肝脏糖异生、促进肝脏糖酵解、提高肝脏胰岛素敏感性。hAMSCs显著改善T2D小鼠高血糖症状可能与其激活PI3K/AKT/INS信号通路有关。
【图文】：

第 3 章 实验结果3.1 hAMSCs 的分离、培养及鉴定首先，将新鲜羊膜组织从医院取回，利用胰酶和胶原酶消化得到hAMSCs，培养hAMSCs至第3代，镜下观察其形态为成纤维状细胞样，形态如图1A。RT-PCR及流式检测结果表明hAMSCs高表达间充质干细胞标志基因CD29、CD73、CD90、CD105。不表达造血干细胞标志基因CD34、CD45、CD133（图1B、1C），低表达主要组织相容性Ⅰ类抗原HLA-ABC，但不表达其共刺激分子CD80、CD86、CD40，不表达主要组织相容性Ⅱ类抗原HLA-DR（图1C、1D）；免疫荧光检测结果表明hAMSCs高表达Nanog、OCT-4、SSEA-4胚胎干细胞标志物（图1E）；另外在体外将hAMSCs成功定向诱导分化为脂肪细胞、骨细胞，证明其具有多项分化潜能（图1F）。

第3章 实验结果3.2 hAMSCs 致瘤性检测分别通过体外双层软琼脂集落形成实验和体内NOD/SCID小鼠皮下成瘤实验鉴定hAMSCs的致瘤性。结果发现，hAMSCs不能在软琼脂上增殖、生长，，未行成集落，而对照组（hepG2组）形成肉眼可见的较大集落群（图2A）体内实验结果表明在移植细胞两个月后，hAMSCs组 NOD/SCID小鼠皮下未见肿瘤形成，而对照组（胚胎干细胞组）皮下可见明显肿瘤形成（图2B）。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1;R-332

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