人血小板裂解液对人牙髓间充质细胞体外增殖与成骨分化的作用研究

发布时间：2020-06-03 12:31

【摘要】：目的口腔牙周支持组织破坏是牙周炎的主要表现,同时也是牙脱落的主因。随着再生医学这个概念的创立以及组织再生技术这些年的发展,从病人体内获取种子细胞并在体外扩大增殖再输入组织缺损的部位,以重构患者残缺的牙周组织,是解决牙周丧失问题新的发展方向。但干细胞体外培养中使用的动物血清成分复杂,在未来临床应用中可能引发异基因的免疫反应以及潜在的人畜共患病等风险。血小板裂解液(Human Platelet Lysate,HPL)是血小板破裂后,储存于血小板α颗粒内的大量生长因子释放至外环境中所获得的一种生长因子富集物。本实验探索HPL对人牙髓间充质细胞(human Dental Pulp Mesenchymal Cells,h DPSCs)体外增殖与成骨分化的影响并研究其作用机制,为HPL替代胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)作用于h DPSCs的体外扩增提供依据。方法分别使用5%、10%、20%的HPL以及10%FBS对健康牙髓组织分别进行原代培养。细胞成活后使用倒置荧光显微镜及扫描电镜观察细胞形状与状态,并计算组织块的成活率;流式细胞术对间充质干细胞特异性的表面抗原CD34、CD45、CD44、CD90、CD105以及Stro-1的表达进行检测;使用增殖及毒性检测试剂盒(cell proliferation and toxicity test kit,cck-8)分别在1d、2d、3d至7d检测细胞的增殖情况;台盼蓝溶液染色实验检测细胞之活性;实时荧光下聚合酶链式的反应(Real time quantitive-polymerase chain reaction,Q-PCR)检测成骨相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)以及runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表达;茜素红溶液法染色检测细胞体外成骨矿化能力。所获得所有数据均使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。结果各实验组与对照组均有成纤维细胞样细胞从组织块中长出,倒置荧光显微镜与扫描电子显微镜下观察其形态相似,均为长梭形,偶见多角形。流式细胞仪检测结果显示CD34(㧟),CD45(㧟),CD44(㧏),CD90(㧏),CD105(㧏),Stro-1(㧏),其符合人间充质来源干细胞的表型特征;cck-8结果显示10%HPL组h DPSCs增殖速度相较于10%FBS组更快,5%HPL组在第4d时与10%FBS组细胞增殖速度相当,各组之间差异有统计学意义(P0.05)。茜素红染色显示10%HPL组细胞成骨能力优于10%FBS组;Q-PCR结果表明10%HPL组在成骨基因BMP-2,ALP,OCN以及RUNX2的表达方面,均优于10%FBS组,差异有统计学意义(P0.05)。结论10%HPL可以有效促进人牙髓间充质细胞的体外扩增以及成骨分化,可以代替FBS作为牙髓间充质细胞体外扩增时的添加物,为牙髓间充质干细胞的临床安全应用提供了理论基础。
【图文】：

间充质细胞,牙髓,细胞基质,旋涡状

胞培养 5-12 d 后，各组均有成纤维细胞样细胞从组织块边缘爬出，，规则呈长梭形，并以旋涡状排列，电镜观察发现细胞胞膜完整，细量的细胞基质；使用 HPL 培养的细胞立体感更强，期间可以发现少（图 1，图 2）。

形态图,形态,胞活性,细胞

图 2 SEM 下细胞形态Fig 2 Cell morphology under SEM胞活性的检测结果显示：10% HPL 组细 HPL 组细胞的活性最低（68.583±3.519%P=0.0281）（表 2）。表 2 各组细胞细胞成活率、活率（ x ± s）2 Cell survival rate and activity of each group（ x0% FBS 5% HPL 10% HPL 0±8.2 26.7±4.7 70±14.1 5±1.882 68.583±3.519 88.424±1.866
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

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