风疹病毒E1结构蛋白在杆状病毒表达系统中的表达和纯化

发布时间：2020-06-04 23:25

【摘要】：目的1、杆状病毒表达系统的方法及蛋白表达优化条件的建立;2、通过杆状病毒系统表达风疹病毒E1全长重组蛋白,成功获得相对纯度的风疹E1重组蛋白;3、为高灵敏度、高特异性血清学方法检测抗原筛选奠定了基础,用于建立高灵敏度和高特异性血清学的检测方法。方法通过将风疹病毒E1蛋白与供体质粒pFastBacHTA用限制性内切酶消化连接后转化到DH10Bac ~(TM)E.colic中,在其感受态内部进行同源重组,用蓝白斑和抗性进行筛选,经鉴定正确后提取含有RV-E1基因组的重组穿梭质粒Bacmid-RV-E1转染到Sf9细胞,收获病毒培养上清,即为P1代重组杆状病毒AcMNPV-RV-E1,使用P1代接种Sf9细胞扩增病毒库,收获细胞上清,即为P2代AcMNPV-RV-E1,经CPE、IFA和PCR鉴定后表明含有RV-E1基因成功转染细胞,并在细胞中进行组装、复制和表达。同上方法接种细胞,收获AcMNPV-RV-E1病毒库。终点稀释法稀释病毒接种细胞,按不同MOI值接种细胞,进行空斑实验,测得病毒滴度。对重组杆状病毒扩增条件进行优化,找出最适宜收获目的蛋白的天数。进而通过镍柱亲和层析法对含有RV-E1目的蛋白进行纯化,并对目的蛋白的表达进行鉴定。结果通过PCR扩增技术,成功获得风疹E1的目的基因,同时与供体质粒pFastBacHTA相连,转化到DH10Bac~(TM)E.coli感受态细胞内进行同源重组,提取含有RV-E1的Bacmid重组穿梭质粒,转染于Sf9细胞中,经杆状病毒表达系统表达后鉴定正确,能够表达出目的蛋白,并对表达条件进行优化后,接种收获蛋白,进行纯化。经鉴定得出,目的蛋白不仅可以被风疹特异性兔多克隆抗体和6*His单克隆鼠抗体识别,还可以与风疹阳性人血清发生结合,表明该蛋白具有免疫反应性。结论1、通过PCR扩增,成功获得RV-E1目的基因,与pGEM-T载体连接克隆,经鉴定后与供体质粒pFastBacHTA双酶切连接,转化到DH10Bac ~(TM)E.coli感受态细胞克隆,提取重组穿梭质粒,感染Sf9细胞,经鉴定后,表明重组杆状病毒能够在细胞内进行组装、复制,成功获得含有目的基因的重组杆状病毒;2、经WB、DB鉴定后,能够与抗体(特异性兔抗、6*His抗体)及RV阳性血清产生反应,表明RV-E1均能与不同种属的抗体进行反应,具有良好的免疫反应性。优化表达条件后成功表达风疹E1蛋白,为建立应用于血清学的检测方法及抗体筛选奠定了基础,可用于血清学应用。
【图文】：

1-A段和RV-E1-B段基因进行扩增，分别得到如表基因片段，电泳条带如图1-1、图1-2所示：图1-1 RV-E1 A段PCR扩增结果NA marker DL2000； 1：阴性对照； 2：RV-E1基因Ae 1-1. The results for PCR amplification of RV-E1 gene As marker DL2000； 1: Negative； 2: RV-E1 A segmen

图1-3 RV-E1基因全长PCR扩增结果: DNA marker DL2000； 1: RV-E1基因全长PCR扩增产 1-3. The results for full-length PCR amplification of RVmarker DL2000； 1: Full-length PCR amplification of PCR扩增产物送公司进行测序，通过A段、B段到RV-E1全长，，与GeneBank下载序列2B型毒株少了一个碱基G，核酸1142位由C→T，导致氨胶电泳显示A段大小为1036bp，B段大小为819全长T-A克隆重组质粒的构建因T-A克隆重组质粒的鉴定酶得到的RV-E1基因PCR产物进行胶回收纯化后过T-A互补作用进行连接，得到含有RV-E1的T
【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2697130