肠道病毒EV71和CA16的VP1蛋白在人支气管上皮细胞中对天然免疫相关信号分子的表达及T细胞免疫反应的影响

发布时间：2020-06-05 08:32

【摘要】：肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71或EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsakievirus A 16,CV-A16或CA16)[1]是手足口病的主要病原,二者可引起相似临床症状,但感染机制的差异使CV-A16疫苗研究迟迟落后于EV-A71。因此,深入探索这两种病毒与宿主免疫系统的相关性,仍具有重要的理论及应用意义。前期研究证明,EV-A71和CV-A16均可通过呼吸道感染人体,而呼吸道上皮细胞的胞内外均具有系统的模式识别受体(pattern recognition receptor PRR[1]),这些PRR对各类病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern PAMP[1])均具有识别的能力[2],从而启动天然免疫反应相关信号分子的表达调控程序。迄今为止,对肠道病毒与支气管上皮细胞间的相互作用及其对天然免疫反应信号变化趋势的影响仍尚未明确。因此,本研究设计了作为肠道病毒主要抗原的VP1蛋白在支气管上皮细胞16HBE中的单独表达体系,来探究其对天然免疫相关信号分子的表达及T细胞免疫反应的影响[2]。首先扩增EV-A71和CV-A16的VP1序列,分别插入至载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA-EV-A71-VP1和pcDNA-CV-A16-VP1。经双酶切及测序鉴定,两种重组质粒均正确构建,并且经Wester blot检测VP1蛋白均表达正确。然后分别转染人支气管上皮细胞16HBE,于转染后24、48和72 h收集样本,实时定量PCR法检测16HBE细胞中天然免疫反应相关信号分子的表达情况[2]。结果表明:一方面,EV-A71-VP1和CV-A16-VP1两个实验组的信号分子表达谱在时间和数量上呈现截然不同的特点。转染后24h到72h,EV-A71-VP1实验组的表达量呈现出跳跃式的起伏,特别是 IFN-β、OX40L、IFN-a、IFN-γ、RANKL、IL-2,在 24h 时相较于基线对照均处于10倍至350倍的高位,而48h则剧烈降至10倍以下的水平。但CV-A16-VP1实验组的表达量则在时间上趋于稳定,而且数量上始终处于10倍以下的水平。另一方面,我们发现CV-A16-VP1实验组上调而EV-A71-VP1实验组下调的信号分子基本是发挥抗炎作用的因子,如IL-4、IL-13、GITRL;相反的,CV-A16-VP1实验组下调、EV-A71-VP1实验组上调的信号分子则基本是促炎因子。因此,结果表明EV-A71的VP1在一定程度上启动了机体的天然免疫反应,而CV-A16的VP1效果却不明显。最后,为评价以上天然免疫相关信号分子的综合效应,本实验进行了人IFN-γ特异性Elispot实验,发现两个病毒实验组的结果具有相似性,即T细胞都发生了显著的非特异性增殖;但经DC细胞递呈后的T细胞却都没有显著的特异性增殖。综上所述,肠道病毒EV-A71和CV-A16的VP1蛋白在16HBE中分别表达后,细胞中天然免疫相关信号分子的表达情况具有差异性[2];但对T细胞非特异性增殖和特异性增殖的作用具有相似性。因此,本实验为进一步探讨不同肠道病毒早期通过呼吸道感染机体的机制提供了实验依据。
【图文】：

图１肠道病毒的胞内增殖过程逡逑３．天然免疫的分子机制逡逑在２０世纪６０年代到９０年代，获得性免疫应答主导了免疫生物学，直到一位逡逑致力于Ｔ细胞免疫学研宄的学者——察尔斯？简威（Ｃｈａｒｌｅｓ邋Ｊａｎｅｗａｙ）邋［１８］在１９８９逡逑年发表了一篇文章，指出人们普遍低估了先天免疫系统的作用［１９］。他首次提出了抗逡逑原呈递细胞上存在模式识别受体（ｐａｔｔｅｒｎ邋ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，邋ＰＲＲ－２°＿），，其逡逑是一种可以感知病原体的化学产物的特定基序［２１］，然后指导Ｔ细胞去执行不同功能。逡逑这个新的假说纷纷遭到质疑，但十多年后，法国生物化学家朱尔斯？霍夫曼（Ｊｕｌｅｓ逡逑Ｈｏｆｆｍａｎｎ）的昆虫的Ｔｏｌｌ受体、美国遗传学家布鲁斯？比托勒（Ｂｒｕｃｅ邋Ｂｅｕｔｌｅｒ）逡逑的哺乳动物中的研究则有力的证明了该假说的成立［２２’２３］。因此，他俩联合获得２０１１逡逑年诺贝尔奖。其实，ＰＡＭＰ和ＤＡＭＰ在多大程度上通过非自身或自身信号来诱导获得逡逑性免疫反应来影响免疫耐受仍然是一个有争议的讨论问题［２４’２５］。早在２０世纪７０逡逑年代，美国洛克菲勒大学的加拿大免疫学家（Ｒａｌｐｈ邋Ｓｔｅｉｎｍａｎ）邋［２１］就开始研究该概逡逑念中的关键参与者：树突状细胞Ｍ。他证明了树突细胞是比巨噬细胞更有效的抗原逡逑呈递细胞，并且它们是Ｔ细胞的主要指导者。所以斯坦曼成为了第三位获得２０１１逡逑

的免疫应答的激活。那么激活了天然免疫之后呢？邋Ｋａｕｆｍａｒｍ等人制作了一个天然免逡逑疫与适应性免疫的联系思维导图，将关键节点罗列出来，可以让我们更好的有一个逡逑框架式的理解，如
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2697781