蛋氨酸脑啡肽对荷瘤小鼠髓样抑制细胞调节作用的研究

发布时间：2020-06-05 23:22

【摘要】：目的:髓样抑制细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)是指髓系来源的、未成熟的、对T细胞介导的免疫应答具有抑制作用的一群异质细胞。MDSCs细胞可抑制机体免疫细胞发挥正常固有性免疫和特异性免疫,使免疫细胞处于无应答或者耐受状态而不能及时清除变异的癌前细胞,失去杀伤肿瘤细胞的能力。MDSCs细胞还通过非免疫机制如促进肿瘤新生血管形成、肿瘤细胞侵袭及转移,参与调节肿瘤的生物学行为。MDSCs细胞对于肿瘤及其他疾病的负向调节作用得到了越来越多的重视,调控MDSCs细胞及其免疫抑制功能可能是一种潜在的癌症治疗方法。蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin,MENK)是一种由五个氨基酸残基组成的内源性阿片肽,具有自分泌旁分泌特点,广泛存在于神经内分泌系统。MENK具有显著的免疫调节作用及抗肿瘤作用。通过调控阿片受体表达与阿片受体结合,MENK可诱导肿瘤细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,对多种肿瘤如黑色素瘤,脑胶质瘤,肺癌及胃癌等产生抗肿瘤作用。MENK也可以通过对免疫系统细胞产生免疫调节作用,直接增强免疫系统细胞对肿瘤细胞的杀伤作用或改变肿瘤微环境进而发挥抗肿瘤作用。我们前期对MENK的免疫调节作用进行了系统研究,证实了MENK对T细胞,巨噬细胞,NK细胞及DC细胞均有调节作用,但是MENK对于MDSCs细胞的调控作用及机制尚未明确,需进一步论证。我们通过MENK作用于荷瘤小鼠脾脏及骨髓MDSCs细胞体外实验及MENK作用于s180肉瘤荷瘤小鼠体内实验的研究,探讨MENK对MDSCs细胞的免疫调节功能及作用机制,完善MENK免疫调节作用网络。实验方法:本研究分别通过体外实验和体内实验探讨MENK对荷瘤小鼠MDSCs细胞的调控作用。体外实验中采用8-10周雌性C57BL/6J小鼠,通过双侧腋皮下注射腹水瘤细胞建立荷瘤小鼠模型,应用流式细胞术检测荷瘤小鼠与正常小鼠各器官中MDSCs细胞分布情况;免疫磁珠阳性分选荷瘤小鼠脾脏及骨髓的髓样抑制细胞,体外培养并分别给予不同剂量MENK刺激,应用CCK8法检测MDSCs细胞增殖及活性,确定体外实验最佳浓度;分别采用MENK及MENK联合阿片受体阻断剂纳曲酮(Naltrexone,NTX)刺激体外培养的骨髓及脾脏来源的MDSCs细胞进行后续实验研究:应用流式细胞分析技术分别检测各组MDSCs细胞中ROS含量,应用RT-qPCR技术检测MDSCs细胞μ和δ阿片受体mRNA表达水平,应用ELISA法检测MDSCs细胞上清分泌细胞因子IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10及TGF-β1水平。体内实验中建立与体外实验相同的荷瘤小鼠模型,经MENK或MENK联合NTX连续腹腔注射治疗14天后,检测荷瘤小鼠肿瘤体积、重量变化;伊红-苏木精染色观察肿瘤组织形态学变化;免疫组织化学法分别检测肿瘤组织中CD11b+细胞及Gr-1+细胞表达情况;ELISA法检测小鼠血清中细胞因子IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10及TGF-β1变化;免疫磁珠阳性分选治疗后的荷瘤小鼠MDSCs细胞,应用流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏和骨髓MDSCs细胞及其亚群比例变化;RT-qPCR法检测MDSCs细胞阿片受体MOR和DOR基因表达水平,检测MDSCs细胞免疫抑制功能相关分子Arg-1、iNOS的mRNA表达水平,检测MDSCs细胞中基因Ets-1,sted1b的mRNA表达水平。实验结果:1、与正常小鼠相比,荷瘤小鼠免疫器官中MDSCs细胞含量及比例增加。流式细胞术分析结果显示正常小鼠脾脏和外周血MDSCs细胞含量及比例低于荷瘤小鼠(P0.01),荷瘤小鼠器官中MDSCs细胞所占比例由高至低依次为:骨髓、外周血、肿瘤组织、脾脏、淋巴结和胸腺。2、经免疫磁珠阳性分选总体MDSCs细胞及其亚群细胞纯度均显著提高,脾脏来源MDSCs细胞纯度80%,骨髓来源MDSCs细胞纯度90%。3、MENK对体外培养MDSCs细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性,最佳浓度为1.25mg/ml。4、与对照组相比MENK降低脾脏来源MDSCs细胞中ROS的含量(P0.05),骨髓来源MDSCs细胞中ROS含量呈下降趋势。5、与对照组相比MENK上调MDSCs细胞MOR和DOR基因表达水平(P0.01),NTX可阻断此效应。6、MENK促进脾脏来源MDSCs细胞分泌IL-4(P0.05),促进骨髓来源MDSCs分泌IL-6(P0.05),其他细胞因子未表现出显著变化。7、经MENK腹腔注射治疗后,荷瘤小鼠肿瘤及体积均显著降低(P0.05),H-E染色结果显示与对照组相比MENK组在肿瘤组织交界处淋巴细胞侵润明显增加增加;免疫组织化学染色结果显示荷瘤小鼠肿瘤组织中,经MENK治疗后Gr-1阳性细胞与其他两组相比减少,CD11b阳性细胞在三组间无明显变化。8、ELISA结果显示经MENK治疗后荷瘤小鼠血清中TGF-β1下降,IL-4、IL-6及IL-10含量增加(P0.05)。9、MENK显著下调荷瘤小鼠脾脏中总体MDSCs细胞比例(P0.05),降低PMN-MDSCs比例(P0.01),增加M-MDSCs比例(P0.05),骨髓中MDSCs细胞及其两个亚群所占比例均呈下降趋势。10、MENK提高MDSCs细胞中Arg-1基因表达水平,下降iNOS基因表达水平(P0.05);MENK下调MDSCs细胞中setd1b及Ets-1基因表达水平(P0.01)。11、MENK体内治疗上调MDSCs细胞MOR和DOR基因表达水平(P0.01),在脾脏中NTX可完全阻断这种作用(P0.01)。结论:1、肿瘤发生环境中,小鼠各免疫器官中MDSCs细胞增多。2、MENK对荷瘤小鼠MDSCs细胞具有负向调节作用,抑制MDSCs细胞增殖,降低荷瘤小鼠脾脏及骨髓中MDSCs细胞比例,削弱MDSCs细胞的免疫抑制功能同时抑制肿瘤增长。3、MENK对MDSCs细胞两个主要亚群的具有不同调节作用,MENK主要通过降低荷瘤小鼠脾脏中PMN-MDSCs亚群比例,降低总体MDSCs细胞比例。4、MENK可能通过MDSCs细胞中μ和δ阿片受体结合,影响MDSCs细胞中Ets-1及setd1b基因表达,干扰MDSCs细胞的免疫抑制功能。
【图文】：

MDSCs 在荷瘤小鼠中枢及外周免疫器官中分测荷瘤小鼠骨髓、淋巴、肿瘤组织、外周血各器官 MDSCs 分布比例的统计分析，，MDSC瘤组织、脾脏及淋巴结，在胸腺中含量最低

图 2 MDSCs 在正常小鼠脾脏和外周血中分布比例细胞术检测正常小鼠外周血及脾脏中 MDSCs 分布比例；B:代SCs 所占比例统计分析，结果显示正常小鼠脾脏中 MDSCs 的含量。珠分选纯化荷瘤小鼠脾脏和骨髓 MDSCs 结果磁珠 2 次阳性分选，分别从 C57BL/6J 荷瘤小鼠的脾细s。流式细胞术分别检测纯化前后的 MDSCs 细胞比例小鼠脾脏中总体 CD11b+Gr-1+细胞比例为（9.85±1.76ighly6-Clow细胞纯度为（16.45±2.35）%，亚群 CD11b+24.20±1.0）%；纯化后，总体 CD11b+Gr-1+细胞比例为（y6-Ghighly6-Clow细胞纯度高达（80.2±3.0）%，亚群 CD11
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2698768