从大鼠胰腺中分离提取胰岛的方法及其活性的检测

发布时间：2020-06-06 12:54

【摘要】：大鼠的胰腺是一种类似脂肪质地、内部呈网状、但其颜色较脂肪淡、位于腹腔深处的腺体器官。在腹腔中,胰腺位于肝下方,与胃、十二指肠以及脾相连,其上有丰富的血管网络,胰腺外有间质细胞形成的包膜,包膜将胰腺分割成胰腺小叶。胰腺小叶主要由腺泡、导管和胰岛组成。其中泡心细胞存在的腺泡腔由单层腺泡细胞围成,形成大小不等的腔隙,同时,腔隙也存在于胰岛细胞与相邻的腺泡细胞之间,胰岛细胞间小管存在于胰岛细胞之间。被包膜包裹着的胰岛细胞主要包括4种细胞,其中胰岛β细胞主要分泌胰岛素。另外,胰腺组织中也有成纤维细胞和较为丰富的毛细血管。胰腺大体上可以被划分为外分泌腺和内分泌腺两部分,外分泌腺主要产生胰液,包含多种消化酶,分泌后的胰液从胰管流入十二指肠;内分泌腺主要是由几种细胞构成的胰岛,分泌两种动态调节血糖变化水平的激素。研究已经证实糖尿病主要是由胰岛内分泌功能紊乱而引起的,而消化系统疾病则是由胰腺外分泌的功能失调而致。因此,通过成熟有效的胰岛分离提取方法得到大量具有生物学活性的胰岛,并通过胰岛移植来达到救治糖尿病病人的目的显得格外重要。在动物模型中应用胆管灌注法分离提取胰岛较传统的方法来说,具有高效率和高活性的优点,但是其操作较传统的胰岛提取方法更繁琐和复杂。近年来,不少课题组在分离提取操作上做了一些改进,并对分离提取的胰岛冷冻保存进行了尝试,为后续对糖尿病患者胰岛移植的研究奠定了实验基础。本论文中,我们借鉴已有的胆管灌注分离胰岛的方法,在此基础上对结扎处进行改良,将近十二指肠处的结扎改为胆管和胰管开口附近两端十二指肠上结扎,最大程度的保留胰管运送胶原酶,从大鼠胰腺组织中分离提取胰岛细胞,并利用胰岛特异染色法鉴定所分离的胰岛细胞的完整度。本实验中,以Wistar雄性大鼠作为实验对象,选择0.2%V型胶原酶,酶浓度相对于现有报道较高,采取传统的剪切法和经过上述改良的胆管灌注法分离提取胰岛后,利用二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色方法检测和比较两种方法提取的细胞存活率。通过实验发现胆管灌注法提取的胰岛细胞半小时内的活性明显高于剪切法提取的胰岛细胞活性。另外,对分离提取的胰岛细胞分别用低糖和高糖刺激,利用ELISA检测胰岛素的分泌,结果显示,与剪切法相比,改良后的胆管灌注分离得到的胰岛细胞可以对高浓度葡萄糖刺激产生正常应激反应而分泌胰岛素,说明分离提取后的胰岛细胞仍保持正常的胰岛分泌功能。再次,我们对两种不同方法分离提取的胰岛细胞在显微镜下进行观察发现,利用改良的胆管灌注法提取的胰岛,其包膜破碎的现象较少。最后,我们利用RT-q PCR方法通过检测胆管灌注法分离提取的胰岛分泌蛋白质激素的m RNA水平来评估胰岛的活性和功能。综上,本实验的研究结果证明利用我们改良的胆管灌注法提取的胰岛细胞活性和分泌功能较剪切法更为有效。本研究将为后续临床研究糖尿病治疗奠定了实验基础和理论依据。
【图文】：

剖析图,胰岛,内分泌腺,外分泌腺

图 1.1 人的胰腺结构剖析图胰腺分为外分泌腺和内分泌腺两大部分。外分泌腺主要产生胰液，即多种，分泌后的胰液从胰管流入十二指肠。胰腺的内分泌腺细胞团被包膜包是由胰岛细胞组成[2]。胰岛大概占总胰腺质量的 1-2％，其主要功能是通胰岛素和胰高血糖素，参与调节碳水化合物，脂质和蛋白质来源的各种营的储存和利用[3]。胰岛细胞主要分为胰岛 α 细胞和胰岛 β 细胞。两种细胞在不同种属胰岛布有所区别。如，在小鼠和其他啮齿动物的胰岛核心部分主要被β细胞所而α细胞聚集在外围区域[5,6]。而在人类和其他灵长类胰岛中，α细胞并于外围，可以分布在胰岛的不同位置[7]。在狗和猪胰岛中，β细胞和α细

功能图,胰岛,内细胞团,功能

第 1 章绪论各半分布，而在猴子的胰岛中，α细胞不规则的在内部核心处散在出现[岛的β细胞主要聚集在中心核和初级内分泌细胞中，而α细胞占据胰岛，但在该区域也能观察到β细胞。胰岛中还有一种细胞叫 pp 细胞，主胰岛边缘，偶尔会扩散到胰岛的内部，但是，大多数 pp 细胞集中在胰区域[10,11]。大鼠的胰腺是脂肪质地、网状、颜色较脂肪淡但密度较脂肪大的组织，腹部肝下方，与胃、十二指肠以及脾相连，，其上有丰富的血管网络[12]。间质细胞形成的包膜，其将胰腺分割成胰腺小叶，胰腺小叶由腺泡、导组成。如图 1.2 所示，胰岛细胞主要包括α细胞、β细胞（朗格汉斯胰岛胞和 pp 细胞等[13,14]。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1;R-332

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