沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抗氧化应激作用及对IL-6和IL-12的抑制作用初步研究

发布时间：2020-06-09 12:26

【摘要】：目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct.)pORF5质粒蛋白能否通过上调宿主细胞NQO1的表达抑制氧化应激反应及IL-6和IL-12的产生,为进一步阐明pORF5质粒蛋白在Ct的致病机制中的作用提供理论依据。方法:pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转化的大肠杆菌E.coli XLl-blue接种至含Amp的LB固体平板,扩大培养后经IPTG诱导表达GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白用Glutathione Sepharose 4B纯化及PreScission Protease切除GST标签后得到pORF5质粒蛋白,SDS-PAGE及Western blotting分析并鉴定GST-pORF5融合蛋白和pORF5质粒蛋白。BCA法测定pORF5质粒蛋白浓度,多粘菌素B处理去除内毒素。以不同浓度(0、5、10、15 μg/mL)pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞24 h及最佳浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞不同时间(0、6、12、18、24 h)后,RT-qPCR 检测 HeLa 细胞 NQO1的mRNA转录水平,Western blotting检测HeLa细胞NQO1的蛋白表达情况;收集不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞18 h的细胞或培养液上清,LPS刺激为阳性对照组,分别检测丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)及总抗氧化能力(T-AOC);10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激感染Ct的HeLa细胞不同时间,并以相同时间点PBS处理感染衣原体的HeLa细胞作为对照,分别检测MDA、T-SOD及T-AOC,间接免疫荧光法检测包涵体形成;不同浓度pORF5质粒蛋白刺激经PMA处理的THP-1细胞24 h及最佳浓度pORF5质粒蛋白刺激经PMA处理的THP-1细胞不同时间,收集细胞培养液上清,ELISA分别检测IL-6和IL-12的水平。10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激经siRNA-NQO1干扰NQO1表达的HeLa细胞及未干扰的对照细胞18 h后,分别检测MDA、T-SOD及T-AOC;15μg/mL pORF5质粒蛋白刺激经siRNA-NQO1干扰NQO1表达的THP-1细胞及未干扰的对照细胞18 h后,ELISA分别检测IL-6和IL-12的水平。结果:1.pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转化菌经诱导表达分子量约为54 kDa的GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经纯化及切除GST标签后得到分子量约为28 kDa的pORF5质粒蛋白。2.不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞24h后,RT-qPCR及Western blotting结果显示HeLa细胞中NQO1的mRNA水平及蛋白水平呈浓度依赖性上升,且在10 μg/mL时上调最明显;以10μg/mL浓度的pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞不同时间后Western blotting结果显示当刺激时间为18h,HeLa细胞中NQO1的蛋白水平上调最明显。3.不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞18 h后,MDA、T-SOD及T-AOC检测结果显示:与LPS 阳性对照组相比,当pORF5质粒蛋白刺激浓度为10 μg/mL时,MDA含量最少,为0.21±0.02 nmol/mg(P0.01),T-SOD 及 T-AOC 含量最高,分别为 48.79±1.83 U/mL(P0.01)和 50.76±0.94U/mL(P0.01)。4.10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激感染Ct的HeLa细胞不同时间后,相比于PBS对照组,MDA检测结果显示在18h时,MDA的减少程度最明显,为1.35±0.04 nmo1/mg(P0.01):T-SOD和T-AOC检测结果均显示在18h时,二者的升高程度最明显,分别为26.61士2.21 U/mL(P0.01)和 34.40±2.50U/mL(P0.01)。间接免疫荧光结果显示:对照组IFU为7.13 × 105/mL,pORF5刺激组IFU为9.03 X 105/mL,包涵体数量较对照组多26.7%(P0.05)。5.不同浓度pORF5质粒蛋白刺激经PMA预处理的THP-1细胞24 h后,ELISA结果显示IL-6及IL-12的水平呈浓度依赖性减少且在浓度为15μg/mL时,IL-6及IL-12的水平分别为3.83±0.37 pg/mL(P0.01)和 2.24±0.01pg/mL(P0.01);15 μg/mL pORF5 质粒蛋白刺激经PMA预处理后的THP-1细胞不同时间后,ELISA结果显示IL-6及IL-12的水平呈时间依赖性减少且在刺激时间为18 h时,IL-6及 IL-12 的水平分别为 2.07±0.55 pg/mL(P0.05)和 2.31±0.14 pg/mL(P0.01)。6.pORF5质粒蛋白刺激干扰NQO1蛋白表达的HeLa细胞后,MDA、T-SOD和T-AOC检测结果显示:与未干扰的对照组相比,MDA 含量增加 0.92±0.27 pg/mL(P0.05),T-SOD 和 T-AOC 含量分别降低 21.90±3.36U/mL(P0.05)和 22.51±2.82U/mL(P0.01)。pORF5质粒蛋白刺激干扰NQO1蛋白表达的THP-1细胞后,ELISA结果显示:与未干扰的对照组相比,IL-6及IL-12的水平分别升高11.16±3.13pg/mL(P0.05)和6.91±0.32pg/mL(P0.01)。结论:沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过上调宿主细胞NQO1蛋白的表达发挥抗氧化应激作用并抑制IL-6及IL-12的产生。
【图文】：

第 4 章 实验结果白的表达、纯化与鉴定合蛋白的诱导表达-1/pORF5 重组质粒的 E.coli XL1-blue 大肠杆，，扩大培养再用 IPTG 诱导表达重组蛋白，S上清在大约 54 kDa 位置处有明显的粗蛋白条 融合蛋白分子量相符（图 1）。kDa M 上清 沉淀

图 2 切除标签后 pORF5 质粒蛋白的 SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of GST-tag removed pORF5 plasmid protein1-4: purified pORF5 plasmid proteinpORF5融合蛋白和pORF5质粒蛋白的Western blott性 GST 一抗及羊抗兔 IgG 二抗孵育 GST-pORF5 融合蛋白，显示在 54 kDa 位置处有明显的一条带（图 3A）；以本课题性pORF5一抗及羊抗鼠IgG二抗孵育纯化酶切后的pORF blotting 结果显示在 28 kDa 位置处有明显的一条带（图 3BB3 GST-pORF5 融合蛋白和 pORF5 质粒蛋白的 Western blotting 鉴定28 kDa
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R374

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 李忠玉;汪世平;吴移谋;钟光明;陈玎;;沙眼衣原体质粒蛋白pORF5核酸疫苗抗衣原体生殖道感染免疫保护作用[J];中国科学(C辑:生命科学);2008年09期

2 李忠玉;吴移谋;黄秋林;周洲;;沙眼衣原体pORF5蛋白真核表达系统的构建与鉴定[J];南华大学学报(医学版);2010年01期

3 李忠玉;汪世平;吴移谋;朱翠明;何卓;;沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定[J];中国现代医学杂志;2009年04期

4 李忠玉;吴移谋;黄秋林;钟光明;周洲;粟盛梅;;质粒蛋白pORF5在沙眼衣原体感染细胞中的定位及免疫原性研究(英文)[J];免疫学杂志;2011年02期

5 何战胜;邹燕;粟胜梅;雷文波;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白免疫优势片段的筛选与鉴定[J];中国免疫学杂志;2016年01期

6 卜继常;邹燕;聂倩;雷文波;周洲;陆春雪;陈超群;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5蛋白通过激活PI3K/Akt信号通路抑制细胞凋亡[J];中国免疫学杂志;2018年03期

7 周辉;黄秋林;李忠玉;吴移谋;谢小兵;马康康;曹文娟;周洲;陆春雪;钟光明;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白经TLR2激活MAPKs信号通路诱导人单核细胞产生前炎症细胞因子[J];中国科学:生命科学;2013年04期

8 李群;聂倩;何蓓;邹燕;粟盛梅;周洲;陈超群;陆春雪;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白调控MDM2-p53通路抑制细胞凋亡的研究[J];中国病原生物学杂志;2019年06期

9 刘安元;李群;聂倩;陶立坚;粟盛梅;周洲;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活p38MAPK和NALP3信号通路调控THP-1细胞IL-1β分泌的研究[J];中国病原生物学杂志;2018年02期

10 曹文娟;戴文婷;杨晓玉;粟盛梅;龚思露;贺红梅;周洲;唐双阳;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活NALP3炎性复合体诱导THP-细胞产生IL-1β和IL-18[J];中国免疫学杂志;2015年05期

相关会议论文 前9条

1 何战胜;粟盛梅;龚思露;邹燕;雷文波;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5蛋白致炎症反应作用及机制初步研究[A];第十届全国免疫学学术大会汇编[C];2015年

2 李忠玉;戴文婷;邹燕;雷文波;粟盛梅;何战胜;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对HeLa细胞蛋白表达谱的影响[A];第十一届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2016年

3 戴文婷;粟盛梅;龚思璐;邹燕;雷文波;李忠玉;;沙眼衣原体质粒蛋白pORF5相互作用宿主蛋白的筛选及鉴定[A];中华医学会第十二次全国临床微生物学术年会暨第十一次全球华人临床微生物学与感染症学术年会论文汇编[C];2015年

4 邓红玉;李忠玉;吴移谋;陆春雪;周洲;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白诱发小鼠生殖道免疫损伤初步研究[A];2012全国临床微生物与感染免疫学术研讨会论文集[C];2012年

5 马康康;李忠玉;戴文婷;杨晓玉;贺红梅;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白拮抗LL37抗菌肽活性初步研究[A];中华医学会2014全国微生物学与免疫学学术年会论文汇编[C];2014年

6 杨晓玉;粟盛梅;龚思璐;邹燕;雷文波;周洲;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对HeLa细胞自噬的影响[A];中华医学会第十二次全国临床微生物学术年会暨第十一次全球华人临床微生物学与感染症学术年会论文汇编[C];2015年

7 何蓓;聂倩;李群;欧阳东成;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活Nrf2/HO-1信号通路调控细胞凋亡[A];第十三届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2018年

8 李忠玉;雷文波;卜继常;粟盛梅;;沙眼衣原体质粒蛋白pORF5通过上调HMGB1抑制细胞凋亡机制初步研究[A];第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2017年

9 曹文娟;杨晓玉;戴文婷;马康康;陆春雪;周洲;唐双阳;李忠玉;;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白诱导THP-1细胞分泌促炎性细胞因子机制初步研究[A];中华医学会2014全国微生物学与免疫学学术年会论文汇编[C];2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 李群;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抗氧化应激作用及对IL-6和IL-12的抑制作用初步研究[D];南华大学;2019年

2 邓红玉;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白致小鼠生殖道炎症反应及其免疫机制初步研究[D];南华大学;2012年

3 戴文婷;沙眼衣原体质粒蛋白pORF5引起的宿主差异蛋白的筛选及功能初步研究[D];南华大学;2015年

4 杨晓玉;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对HeLa细胞自噬与凋亡的影响[D];南华大学;2015年

5 龚思露;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过上调DJ-1蛋白表达激活ERK信号通路抑制细胞凋亡[D];南华大学;2016年

6 马康康;pORF5质粒蛋白抑制LL37抗菌肽促进沙眼衣原体感染及机制初步研究[D];南华大学;2013年

7 周辉;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白经TLR2激活MAPK信号通路诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子[D];南华大学;2012年

8 曹文娟;沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过激活NALP3炎性复合体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18[D];南华大学;2014年

9 邹燕;沙眼衣原体pORF5蛋白激活PI3K/AKT通路介导MDM2-p53相互作用轴抑制细胞凋亡[D];南华大学;2017年

10 雷文波;沙眼衣原体质粒蛋白pORF5通过上调HMGB1诱导线粒体自噬抑制细胞凋亡[D];南华大学;2017年

本文编号：2704687