AIV-PB2特异性M1GS核酶的构建及其活性研究
发布时间：2020-06-10 18:25
【摘要】：本论文针对禽流感病毒(AIV)的关键基因--复制酶基因PB2,设计并构建了八种M1GS核酶,分别是M1GS-T_(436)、M1GS-T_(934)、M1GS-T_(1105)、M1GS-T_(1523)、M1GS-T_(1771)、M1GS-C_(341)、M1GS-C_(1531)、M1GS-C_(1760)。通过体外切割实验,检测其对底物RNA的切割活性,结果显示:M1GS-T_(436)、M1GS-T_(1105)、M1GS-T_(1523)、M1GS-C_(1531)和M1GS-C_(1760)这五种核酶均具有明显的特异切割活性,核酶M1GS-C_(341)也具有较强的切割活性,但属于非特异性切割,而核酶M1GS-T_(934)和M1GS-T_(1771)则无明显的切割活性。进一步通过体外切割产物电泳图及各核酶相对活性表等一系列进行分析,选择活性较高的三种核酶M1GS-T_(1105)、M1GS-T_(1523)、M1GS-C_(1760)作为对象,分别构建上述三种核酶的真核表达重组质粒(M1GS/T_(1105)-PLXSN、M1GS/T_(1523)-PLXSN、M1GS/C_(1760)-PLXSN)以及PB2蛋白与绿色荧光蛋白融合表达的质粒(PB2-EGFP),分别将这些M1GS真核表达重组质粒与PB2-EGFP共转染MDCK细胞。Western Blot结果显示,三种M1GS核酶均能显著抑制蛋白PB2的表达;扫描细胞的荧光强度后发现转染核酶M1GS-T_(1105)、M1GS-T_(1523)和M1GS-C_(1760)可大大降低绿色荧光的强度,抑制率分别为77.53±1.98%、58.84±0.86%和80.37±1.46%。本文为进一步研究M1GS核酶的胞内乃至动物体内的抗病毒效应提供了良好的材料,并为抗AIV新型核酸类药物的研究与开发奠定了一定的基础。此外,本文亦提出了关于M1GS设计方面的一些观点,为M1GS核酶的相关研究提供了有益的参考。
【图文】：
1.8 对转化子快速鉴定与测序挑取疑似阳性菌菌落接种至含氨苄抗性的 5ml LB 液体培养基中，200rpm 37℃振荡h，12,000rpm 离心 30s，弃上清。菌体处理后进行琼脂糖凝胶电泳，通过条带比对初菌落质粒的大小[25]。对阳性菌液抽提质粒后 PCR 扩增再次检测并送去测序。2 人工 M1GS 核酶的设计与构建2.1 人工 M1GS 的靶位确定采用计算机软件 DNAMAN 和 RNAstructure 分析 AIV PB2 基因上 mRNA 的序列及征，搜寻切割靶位。大量文献得出高效设计的 GS 有利于引导 RNase P 对靶基因的切割[26，27]。再次参考大量文献的研究成果，通过软件 Genetool，对底物 PB2 基因进行整个序列在的人工核酶 M1GS 作用靶区域。依照模式在 AIV 的 PB2 基因上共搜寻到 T1、T2、T3、T4、T5、C1、C2、C3 八点。如下所示（图 1-1）：
13图 1-4 PB2 基因小片段亚克隆示意图亚克隆的引物设计亚克隆，引物设计如前。隆与筛选照前面所诉，，进行亚克隆后的筛选并鉴定处理。分别将本次成功2-A/pGEM3z、 PB2-B/pGEM3z、PB2-C/pGEM3z。外转录10*转录缓冲液中的亚精胺沉淀，我们严格按以下顺序依次加入，应体系如下：
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373
本文编号：2706678
【图文】：
1.8 对转化子快速鉴定与测序挑取疑似阳性菌菌落接种至含氨苄抗性的 5ml LB 液体培养基中，200rpm 37℃振荡h，12,000rpm 离心 30s，弃上清。菌体处理后进行琼脂糖凝胶电泳，通过条带比对初菌落质粒的大小[25]。对阳性菌液抽提质粒后 PCR 扩增再次检测并送去测序。2 人工 M1GS 核酶的设计与构建2.1 人工 M1GS 的靶位确定采用计算机软件 DNAMAN 和 RNAstructure 分析 AIV PB2 基因上 mRNA 的序列及征，搜寻切割靶位。大量文献得出高效设计的 GS 有利于引导 RNase P 对靶基因的切割[26，27]。再次参考大量文献的研究成果，通过软件 Genetool，对底物 PB2 基因进行整个序列在的人工核酶 M1GS 作用靶区域。依照模式在 AIV 的 PB2 基因上共搜寻到 T1、T2、T3、T4、T5、C1、C2、C3 八点。如下所示（图 1-1）：
13图 1-4 PB2 基因小片段亚克隆示意图亚克隆的引物设计亚克隆，引物设计如前。隆与筛选照前面所诉，，进行亚克隆后的筛选并鉴定处理。分别将本次成功2-A/pGEM3z、 PB2-B/pGEM3z、PB2-C/pGEM3z。外转录10*转录缓冲液中的亚精胺沉淀，我们严格按以下顺序依次加入，应体系如下：
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373
【参考文献】
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本文编号：2706678
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