自噬在肠道病毒71型复制中的作用和机制初步研究

发布时间：2020-06-10 19:50

【摘要】：研究背景和目的肠道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原体之一,由EV71引起的手足口病大部分表现为轻微症状,但仍有部分患者的病情进展为重症神经系统疾病,并引起脑干脑炎,急性弛缓性麻痹,肺水肿和心肺功能衰竭,有较高的病死率。由于目前没有有效预防或治疗EV71的药物和疫苗,虽有进入临床试验的药物或疫苗,但很难广泛应用于人群,仍需继续对EV71感染的机制进行深入研究以探索新的针对EV71的药物靶点。细胞自噬(autophagy)是在真核生物中高度保守的过程,降解长寿命蛋白及衰老细胞器以实现再循环利用,发生在细胞正常生长发育、分化的生理过程中,病原体感染时也会引起自噬的发生。由于在免疫过程中的作用,自噬往往被病原体所利用以逃逸免疫,自噬体膜也可能被病原体重构以利于其复制。相关研究通过体内外实验证明了EV71感染可诱导自噬并促进EV71复制,但其具体分子机制仍未明确。EV71病毒的VP1蛋白位于病毒最外部的部分,能够结合宿主细胞表面受体来协助病毒感染,具有重要的研究意义,VP1蛋白与宿主细胞蛋白存在复杂的相互作用。因此,本研究考虑VP1蛋白可能参与了 EV71诱导自噬的调控机制。故提出猜想:EV71病毒通过其VP1蛋白参与自噬的调控和执行过程。研究方法1.EV71诱导的自噬的检测采用Western Blot技术,检测自噬的生物标志物LC3的转化;构建RD-GFP-RFP-LC3细胞株,通过荧光显微镜对荧光自噬颗粒进行检测。使用qPCR技术检测自噬抑制后的病毒含量,验证EV71病毒复制过程是否需要自噬。2.构建EV71 VP1表达载体,探索VP1蛋白是否参与EV71诱导的自噬将VP1蛋白构建于pEGFP-N1,在表达载体转染后,采用qPCR技术检测自噬相关的基因,采用Westem Blot技术检测自噬相关蛋白,验证EV71 VP1蛋白是否参与EV71诱导自噬的调控机制。3.筛选与VP1蛋白存在相互作用的自噬相关蛋白,并探索其在病毒复制中的作用联合免疫共沉淀技术及质谱技术,筛选与EV71 VP1病毒存在相互作用的自噬相关蛋白;随后设计合成相关蛋白的siRNA,沉默相关蛋白的表达,采用qPCR技术检测病毒的含量变化。结果1.RD-GFP-RFP-LC3细胞构建成功,在EV71感染后可观察到绿色和红色的自噬荧光颗粒。Western Blot检测结果显示以MOI=1感染细胞,在感染后12、24、48h,LC3 Ⅱ的含量均高于对照组;在EV71感染48h后,自噬相关蛋白ATG4B、ATG5、ATG7的蛋白含量增加,而在加入自噬抑制剂3-MA后含量减少。2.qPCR检测病毒含量显示,应用自噬抑制剂3-MA后,细胞内病毒的复制在0h、6h、12h、24h分别减少3.9倍、48.7倍、18.1倍、9.3倍,24h上清病毒含量减少8.3倍(p0.05);应用自噬抑制剂LY294002后,9h和12h的细胞内病毒的含量减少3、2,2倍(p0.05)。3.构建VP1表达载体,在表达载体转染后,qPCR检测显示与对照组相比,转染了pEGFP-N1-VP1后,ATG5在24h升高1.6倍,ATG7在24h时升高1.2倍(p0.05),Western Blot检测显示与对照组和阳性对照pEGFP-N1组相比,转染了pEGFP-N1-VP1 24、48h后,LC3 Ⅱ蛋白量较对照组的明显增加,而添加3-MA抑制自噬后,LC3 Ⅱ蛋白量相对减少。在转染pEGFP-N1-VP1 24h时,自噬相关蛋白ATG4B、ATG5、ATG7的表达也较对照组增加,而添加3-MA抑制自噬后相对减少。4.构建VP1分段表达载体,在表达载体转染后,Western Blot检测显示和pEGFP-N1 相比,与pEGFP-N1-VP1一样,pEGFP-N1-VP1(6)可以引起 LC3发生酯化,LC3 Ⅱ明显增加。此外,ATG5的蛋白含量较pEGFP-N1、对照组增多。5.联合免疫共沉淀技术及质谱技术,筛选出7个与VP1及VP1(6)均存在相互作用的蛋白,其中PHB2参与自噬。6.针对PHB2设计合成siRNA,转染后感染病毒,qPCR检测显示与NC组相比,感染后12、24、48h细胞内PHB2含量减少约77%、52%、82%(p0.05),细胞内病毒RNA含量减少57.6%(p0.05)。结论1.EV71感染后可诱导自噬并促进病毒复制。2.EV71病毒的VP1蛋白的尾部参与EV71病毒诱导自噬的过程。3.EV71 VP1蛋白能够通过其与PHB2的相互作用,参与自噬的调控或执行过程,促进病毒自噬的复制。
【图文】：

２．４实验结果逡逑２．４．１逦ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３邋细胞构建成功逡逑由图２－１可见，在焚光显微镜下观察，，可见广泛存在的绿色荧光和红色荧光，逡逑ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３细胞构建成功。可用于自噬的检测。逡逑＿＿擺＇逡逑ＡＢＣ逡逑图２－１ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３细胞荧光表达情况图（Ａ：白光镜下，ｌＯＯｘＢ：绿色荧光镜下，１０0ｘ逡逑Ｃ：红色荧光镜下，１０0ｘ邋）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｒｅｅｎ邋ａｎｄ邋ｒｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３邋（Ａ：邋ｕｎｄｅｒ逡逑ｔｈｅ邋ｗｈｉｔｅ邋ｌｉｇｈｔ，邋１０0ｘ邋Ｂ：邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｇｒｅｅｎ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，邋１０0ｘ邋Ｃ：邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｒｅｄ逡逑ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，邋１００邋ｘ）逡逑２．４．２逦ＥＶ７１感染后可观察到自噬逡逑ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３细胞给予对照、饥饿、雷帕霉素（Ｒａｐａ邋４００邋ｎＭ）、３－ＭＡ逡逑（１０ｍＭ）、ＥＶ７１邋（ＭＯＩ＝ｌ）、ＥＶ７１邋（ＭＯＩ＝５）处理后的荧光图片及邋ＩｍａｇｅＪ邋软逡逑件融合后的图片如图２－２，图２－３，图２－４所示。逡逑图２－２为处理后１２ｈ的细胞荧光图。在１２ｈ时，对照组可见广泛存在的双荧逡逑光，但未见两种荧光的荧光颗粒；饥饿组可见少量绿色和红色荧光颗粒，融合后逡逑为黄色荧光颗粒；自噬激活剂雷帕霉素处理组可见少量绿色和红色荧光颗粒

图２－３不同处理组处理ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３细胞２４ｈ的荧光图（１０0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３邋ｃｅｌｌｓ邋２４ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ逡逑（１０0ｘ）逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373

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本文编号：2706777