前列腺癌细胞来源的外泌体诱导巨噬细胞极化的作用及机制研究

发布时间：2020-06-10 21:21

【摘要】：目的:本文旨在对前列腺癌细胞来源的外泌体在诱导巨噬细胞极化中的作用及其机制进行研究。方法:(1)前列腺癌细胞来源的外泌体(PCa-exos)的分离与鉴定:培养PC-3M-2B4、PC-3M-IE8两种前列腺癌细胞,采用Millipore超滤法提取条件培养基中的外泌体。磷钨酸染色后通过透射电子显微镜对外泌体进行形态上的观察,用纳米粒径分析技术对所提外泌体的颗粒大小进行鉴定,用Western印迹检测外泌体表面的特异性分子标志。(2)PCa-exos诱导巨噬细胞极化:培养THP-1细胞并用诱导为巨噬细胞(Macrophage,Mφ),加入LPS(15 ng/ml)和IFN-γ(50 ng/ml)共同刺激巨噬细胞48h后为M1亚型,加入IL-4(25 ng/ml)刺激巨噬细胞48h后为M2亚型。将所提外泌体(100 ug/ml)加入到巨噬细胞中,48h后为2B4-exo-Mφ与IE8-exo-Mφ型;用绿色荧光PKH67标记的PCa-exos加入到巨噬细胞中,观察外泌体是否能被巨噬细胞吸收以及观察其吸收效率;用CD206抗体对巨噬细胞表面进行荧光染色分型鉴定;用q-PCR、ELISA法检测诱导后的巨噬细胞及其上清中IL-10、IL-1β等因子的表达;用Western印迹检测巨噬细胞经不同诱导处理后细胞中mTOR、AKT、STAT3及其磷酸化蛋白的表达水平。(3)PCa-exos中miRNAs分析:用q-PCR检测提取的外泌体中let-7b等microRNAs的表达。(4)PCa-exos诱导的巨噬细胞功能学实验:用Transwell细胞体外侵袭实验和体外血管生成实验检测各组巨噬细胞上清对前列腺癌细胞的侵袭能力及血管生成能力的影响。结果:(1)电镜、纳米粒径分析结果和Western印迹显示外泌体能通过Millipore超滤方法富集、分离,形态多为圆形,有典型的茶托状结构,直径约在40~160 nm,且表面具有外泌体表面特异性分子标志CD63和TGS101。(2)外泌体在24h内能被巨噬细胞大量吸收,2B4-exo被巨噬细胞吸收的摄取率约为70%,IE8-exo被巨噬细胞吸收的摄取率约为64%;经PCa-exos诱导后的巨噬细胞组中CD206荧光显示强烈,与M2亚型巨噬细胞表达类似,阳性细胞数分别占总细胞数的77%和90%;q-PCR、ELISA法检测IL-10、IL-1β等炎症因子的表达趋势符合M2/TAM亚型巨噬细胞的细胞因子表达谱;Western印迹检测出经PCa-exos诱导后的巨噬细胞其AKT、STAT3的磷酸化蛋白表达水平增高。(3)q-PCR结果显示所提的外泌体中富含miR-23c、miR-451a、let-7b等microRNAs。(4)Transwell细胞体外侵袭实验和体外血管生成实验表明经PCa-exos诱导后巨噬细胞组的上清能够促进前列腺癌细胞的侵袭和血管生成能力。结论:通过Millipore超滤的方法能够提取出符合实验要求的外泌体PCa-exos,其能被巨噬细胞吸收,且约在24 h时达到对外泌体吸收的饱和状态;PCa-exos能够将巨噬细胞诱导为类似M2的表型;2B4-exo和IE8-exo中富含大量的microRNAs,他们可能通过激活AKT和STAT3蛋白将巨噬细胞极化为M2亚型;PCa-exos诱导后的巨噬细胞的上清可以促进前列腺癌细胞PC-3M-2B4和PC-3M-IE8的侵袭和体外血管生成能力。
【图文】：

形态图,条件培养基,超滤法,粒径分析

图 3.1 通过超滤法得到的 PCa-exos 的分析与鉴定（A）：透射电子显微镜下由PC-3M-2B4、PC-3M-IE8 细胞条件培养基中得到的 2B4-exo、IE8-exo 形态图；（B）2B4-exo和 IE8-exo 的粒径分析结果图；（C）：2B4-exo 和 IE8-exo 表面外泌体特异性分子标志 TSG101和 CD63 表达3.2 巨噬细胞吸收 PCa-exos为了验证超滤提出的 2B4-exo 和 IE8-exo 是否能够进入到巨噬细胞进而发挥其生物学作用进行后续实验，我们用 PKH67 绿色荧光染料对外泌体进行染色，将已用荧光标记后的 2B4-exo 和 IE8-exo 各 50μl 加入到已提前接种巨噬细胞的96 孔细胞培养板中，轻微混匀，分别在加入 4 h、12 h、24 h、48 h 后，选取合适视野，在普通显微镜和荧光显微镜下拍照，每组 3 个复孔，每孔 3 个视野，观察各组巨噬细胞表面荧光强度的表达情况。由图 3.2（A）所示，与细胞在明场中的位置相比，能够发出绿色荧光的外泌体存在于巨噬细胞内部，并且在加入 2B4-exo 和 IE8-exo 后，巨噬细胞对 2B4-exo、IE8-exo 的吸收率在 24 h 内会随着时间的增加而增加，到 48 h 时则无明显增加。图 3.2（B）是根据巨噬细胞

统计图,巨噬细胞,荧光显微镜,情况

20图 3.2 巨噬细胞对外泌体的吸收情况 (A) 荧光显微镜下 2B4-exo 和 IE8-exo 加入到巨噬细胞后 4h，12h，24h，48h 的被吸收情况，绿色荧光显示为外泌体已被巨噬细胞吸收；(B)根据不同时间外泌体被巨噬细胞吸收情况所做的统计图3.3 PCa-exos 能够诱导巨噬细胞向 M2 亚型极化3.3.1 PCa-exos 诱导巨噬细胞 M2 型分子标志 CD206 表达增高为了检测 PCa-exos 是否能够诱导巨噬细胞向 M2 亚型极化，我们观察 M2型巨噬细胞的特异性分子标志CD206是否在PCa-exos诱导的巨噬细胞表面表达。我们将提出的 2B4-exo 和 IE8-exo 加入到巨噬细胞中培养 48 h 后，对细胞进行免疫荧光染色，在普通显微镜和荧光显微镜下选取合适的视野拍照，，每组 3 个复孔，每孔 3 个视野，观察并计算各组巨噬细胞表面 CD206 绿色荧光的表达情况。如图 3.3.1（A）所示，M2、2B4-exo-Mφ 和 IE8-exo-Mφ 3 组巨噬细胞表面的 CD206绿色荧光表达强烈，M0、M1 组和无外泌体的对照组 2B4-GW4869、IE8-GW4869
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

【参考文献】