甲型H1N1流感病毒高度敏感的MDCK单克隆细胞株的建立

发布时间：2020-06-11 11:52

【摘要】：甲型H1N1(Influenza A virus H1N1)流感病毒是甲型流感病毒家族中的极其重要的一员,是全球大流感爆发的主要病原体,对人类的健康造成了极大的威胁,日常普通预防和抗病毒药物均不能有效防止其对人类的感染。目前,预防甲型H1N1流感病毒的最有效方法为接种流感疫苗。流感疫苗的传统生产工艺使用鸡胚作为生产基质,存在诸多缺点,WHO推荐使用MDCK细胞作为流感疫苗的优良生产基质。细胞生物反应器大规模培养生产制备病毒疫苗是我国生物医药产业发展的必由之路,而找到理想的细胞作为流感疫苗生产基质是这一工艺的关键环节之一。本文采用有限稀释法制备并建立了MDCK单克隆细胞库,筛选获得了两株甲型H1N1流感病毒高敏感适应性MDCK单克隆细胞株,并对该两株细胞的生长特性和增殖规律进行了研究,根据《中华人民共和国药典》规程要求对细胞进行检定。获得以下主要研究结果:1.从CCTCC引进一株贴壁培养MDCK细胞,利用有限稀释法制备MDCK单克隆细胞。通过探索血清类型、血清浓度、单孔细胞密度对制备单克隆细胞的影响,摸索出理想的有限稀释法制备参数为胎牛血清浓度为15%、单孔接种密度为1个/孔。共制备114株MDCK单克隆细胞,为后续实验提供细胞资源基础。2.复苏MDCK单克隆细胞,细胞活率平均为0.954±0.016;92.1%的细胞3天以内长满;生长状态良好的细胞有66株,占比为57.9%;共有三种细胞形态,包括多角上皮样、成纤维样、岛状样。采用测定血凝滴度值方法筛选出两株甲型H1N1流感病毒高敏感适应性细胞株MDCK CL118和MDCK CL134,其血凝滴度值达到1:128,MDCK单克隆细胞的工作库为1:32。MDCK CL118、MDCK CL134和MDCK工作库细胞的TCID_(50)值分别为7.23 log_(10)TCID_(50)/mL、7.4 log_(10)TCID_(50)/mL、6.33log_(10)TCID_(50)/mL。MDCK单克隆细胞经过20次传代后保持较高较稳定血凝滴度。3.建立主细胞库和工作细胞库,根据《中华人民共和国药典》规程进行检定。形态与官网上一致,单克隆细胞株MDCK CL118和MDCK CL134的复苏活率分别为95.44%和94.95%;密度分别为22.3×10~4/mL和23.5×10~4/mL;最大增值浓度分别为66.6×10~4/mL和38.4×10~4/mL;倍增时间分别为18.7h和23.17h,生长曲线均呈“S”型。染色体数目2n=74-76分别有30张和31张,占比分别为58%和62%。乳酸脱氢酶同工酶实验,MDCK CL118、MDCK CL134、MDCK母细胞的条带数目均为3条,迁移距离完全一致,两株细胞和MDCK母细胞同种属。无菌检查、支原体检查、细胞内外源病毒因子检查实验,MDCK CL118和MDCK CL134单克隆细胞株均为阴性。
【图文】：

均匀分布,胎牛血清,培养的,细胞

西北民族大学生命与科学工程学院 2016 级硕士研究生毕业论文生长速度较新生牛血清快。同传代比例生长 48 h，，胎牛血清培养的 MDCK 细胞汇合可以达到 95%，而新生牛血清培养的 MDCK 细胞汇合度只有 80%。表明胎牛血清MDCK 细胞的体外增殖过程中，可使细胞增殖更加活跃。胎牛血清培养的 MDCK 克隆细胞，长满单层后均匀分布，细胞胞质丰满，核仁清晰。新生牛培养上清液较牛血清上清液浑浊，细胞上清液中细胞出现脱壁现象，死亡细胞增多。因此，用胎血清制备 MDCK 单克隆细胞生长状态更好。2.2.2 血清类型对 MDCK 单克隆细胞株状态对比

生长形态,细胞,流感疫苗,接种疫苗

A 多角上皮样细胞(×100)；B.梭形成纤维样细胞(×100)；C.岛状样细胞（×100图 3-1 MDCK 单克隆细胞的生长形态Figure 3-1 Growth morphology of MDCK monoclonal cells3.3 讨论流感对人类健康威胁严重，及时接种疫苗是预防流感最有效的方法[70]。目前，获准生产人用流感疫苗的细胞系主要有 Vero 细胞和 MDCK 细胞[33]。近年来使用 MDC
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

【参考文献】