烟曲霉中压力响应蛋白OrmA和MtmA参与唑类药物耐受的功能研究

发布时间：2020-06-11 15:44

【摘要】：烟曲霉是在自然环境中广泛存在的腐生菌,也是一种能感染免疫缺陷病人的条件致病真菌。由于免疫抑制剂的广泛使用从而使得患免疫缺陷的病人数量呈不断上升趋势,导致由于烟曲霉感染的侵袭性曲霉病的日益增多。目前抗真菌药物中的唑类药物是临床上应用最广泛的一类,然而,由于唑类药物的长期和广泛应用又使得唑类药物耐药菌株大量出现导致药效下降。在目前临床发现的烟曲霉耐药菌株中,最常见的是唑类药物靶蛋白Cyp51A的突变而导致的,但是仍然有一些非Cyp51A突变而导致的耐药株出现,这些耐药机制很多目前还不清楚。已有研究表明烟曲霉对于外界环境刺激而进化的一些压力响应途径,例如应对药物压力刺激的途径、宿主免疫的氧化应激途径等都对于它的耐药特征和存活起了重要的作用。本研究根据烟曲霉的基因组信息,以及模式酵母中同源蛋白的功能蛋白比对,选择了两种潜在的可能参与压力响应的蛋白OrmA和MtmA,利用分子生物学和细胞生物学等综合手段整体分析了其生物学功能,具体结果归纳如下:1、阐明了OrmA通过调控鞘脂类合成从而参与唑类药物敏感性与毒性的功能。OrmA的缺失增加了烟曲霉对唑类药物的敏感性,通过脂质组学发现OrmA可以调控鞘脂的代谢。OrmA的缺失导致了鞘脂类神经酰胺组分的显著升高,而鞘脂合成抑制剂多球壳菌素能够恢复OrmA的缺失引起的药物敏感性增加。这些数据表明OrmA主要通过影响鞘脂类的合成从而影响了对唑类药物的敏感性。2、OrmA的表达依赖于未折叠蛋白反应中主要的转录因子HacA。OrmA不仅能够响应药物刺激,而且可以响应内质网压力试剂二硫苏糖醇(DTT)和衣霉素(TM)的刺激。进一步研究发现HacA的缺失导致OrmA的表达显著下降,表明HacA对于OrmA的表达是非常重要的。3、小鼠肺部感染模型结果表明OrmA的缺失降低免疫缺陷小鼠的死亡率,说明OrmA对于烟曲霉的毒性是需要的。4、证实在烟曲霉中线粒体转运蛋白MtmA对于氧化压力应激是必需的。烟曲霉中的mtmA是一个必需基因,通过构建条件菌株发现MtmA表达的抑制对氧化压力试剂甲萘醌和过氧化氢极度敏感主要是由于Sod2酶活的显著下降。高表达Sod2能够恢复由于抑制MtmA表达而导致的对氧化压力的敏感,说明MtmA可以调控由Sod2参与的抗氧化逆境。5、研究发现MtmA表达的抑制影响了烟曲霉胞内Zn离子平衡,而Zn离子螯合剂TPEN能够恢复MtmA表达的抑制引起的生长缺陷。这说明Zn离子代谢的紊乱是MtmA缺失致死的关键因素。6、MtmA表达的抑制显著增加了烟曲霉对多种抗真菌药物的耐受性。然而MtmA的低表达导致了与其耐药性相矛盾的现象,即药靶Erg11A/B、Erg5表达的显著下降。进一步研究发现MtmA的低表达引起的耐药是由于多个药泵的高调,尤其是Mdr1的显著高调。而药泵的高调则是由于MtmA的低表达导致转录因子CrzA的持续激活。综上所述,本文阐明了压力响应蛋白OrmA参与唑类药物的耐受性,缺失导致药物易感性而过表达导致耐药。OrmA同时还是烟曲霉产生动物毒性所必需的。烟曲霉中的mtmA是一个必需基因并参与了氧化应激响应、离子平衡,药物耐受等功能。本研究发现进一步拓宽了人们对于烟曲霉中参与抗真菌药物压力响应的重要蛋白的知识理解,也将可能为未来的抗真菌新药靶发现提供理论依据。
【图文】：

个烟曲霉分生孢子，虽然由免疫能力强的个体吸入很少会导致严重疾病[12, 14]。另一方面，在哮喘或囊性纤维化等肺部疾病患者中，烟曲霉感染可引起过敏性支气管肺曲霉菌病，而在免疫功能低下的高危人群中，感染可导致侵袭性曲霉菌病，死亡率为 40%至 90%[15]。对侵袭性曲霉菌病最敏感的免疫缺陷人群包括白血病或基因免疫缺陷病患者和接受骨髓、造血干细胞或实体器官移植的患者[16-18]。烟曲霉侵染人体的过程主要如图 1.1 所示[19]。按人体的免疫机制的启动顺序来描述侵染过程如下，第一道防线：初吸入的烟曲霉的分生孢子会被呼吸道上皮的纤毛除去；第二道防线：较小的烟曲霉分生孢子会避开这种防御，进入肺呼吸道，受到肺泡巨噬细胞、树突状细胞和其他活化白细胞的进一步攻击。如果烟曲霉的分生孢子逃脱，它们就会发芽形成菌丝，并侵入肺和其他器官。这时，第三道防线人体的免疫机制就会触发。到目前为止，关于烟曲霉的致病机理的研究强烈提示：真菌的毒性取决于各种因素，包括真菌患者的免疫状况、真菌的生物学特征、真菌响应外界压力环境的生长能力和应激能力、真菌躲避免疫复合物的机理以及真菌损害宿主的能力。

真菌已经成为人类疾病的主要原因，特别是在免疫功感染的数量增加了 207%[61, 62]。目前临床上应用的用靶点是真菌细胞膜的主要成分麦角固醇、麦角固醇主要成分β-1,3-葡聚糖、β-1,3-葡聚糖的生物合成。真固醇的功能类似物，主要功能是辅助调节膜流动性与膜结合的酶相互作用发挥功能[63]。针对细胞壁的抗真菌药物主要有阿尼芬净、卡泊芬净。棘白菌素类药物是一类广谱性抗真菌药物，主要作合成，通过非竞争性地抑制细胞壁上的参与真菌细胞真菌的细胞壁正常的结构，有效进入细胞，，同时导致激，进而达到抗真菌目的（图 1.2）[1]。因为人类不药物的特点之一就是毒性低，对人体的损伤小，也是抗真菌药物。棘白菌素类药物对念珠菌和曲霉菌有良有一定的抑菌作用，对酵母具有杀菌作用，而单单对64]。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R379

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本文编号：2708120