Pnldc1在小鼠精子发生过程中的功能研究

发布时间：2020-06-11 15:52

【摘要】：精子是父源遗传信息的传递者,精子发生障碍是雄性不育的重要原因之一。精子发生相关调控机制的研究对不育症的诊疗具有重要的意义。非编码小RNA对精子发生的调控作用一直是生殖医学领域的研究热点。生精细胞中最主要的非编码小RNA包括:microRNAs(miRNA)、内源小干扰RNA(endogenous small interfering RNAs,endo-siRNAs)以及piRNA(PIWI-interacting RNA)。piRNA与PIWI蛋白结合形成piRNA介导的沉默复合体(piRNA-induced silencing complexes,piRISC),主要参与转座子沉默,维持生殖细胞基因组的完整性。piRNA-PIWI蛋白复合体还参与前精原细胞新生DNA甲基化重建,并调节圆形精子中某些编码RNA的表达,在精子发生的许多阶段发挥着重要的调控作用。piRNA的生成包括初级piRNA生成通路和次级piRNA生成通路。初级piRNA生成通路始于piRNA长链前体的转录,随后piRNA长链前体在核酸内切酶Zuc/MitoPLD的作用下被切割为piRNA中间体;piRNA中间体与PIWI蛋白结合,发生3’末端核酸外切及2’-O-甲基化修饰,形成成熟的初级piRNA。次级piRNA的成熟同样需要3’末端核酸外切及甲基化修饰。参与piRNA中间体3’端截短的核酸外切酶一直是piRNA研究领域的热点话题。一项在蚕中的研究显示,Parn核酸外切酶家族成员—Pnldc1参与piRNA中间体3’端核酸外切。另一项线虫中的研究显示,Pnldc1在线虫中的同源基因Parn-1同样参与piRNA中间体3’端核酸外切。然而,哺乳类动物Pnldc1的具体功能还未见报道。本研究中,我们尝试对小鼠Pnldc1的分子功能及其对精子发生的影响进行了探究。首先,我们对小鼠Pnldc1的表达模式进行了分析,发现小鼠Pnldc1呈睾丸特异性表达。小鼠Pnldc1高表达于出生后1-3周的睾丸中,而在出生后4-8周逐渐下降。进一步检测发现Pnldc1在小鼠精原细胞、精母细胞及圆形精子中均有表达。随后,我们应用CRISPR/Cas 9技术构建了Pnldc1特异性敲除小鼠。Pnldc1纯合敲除小鼠附睾中无正常精子,睾丸减小,雄性完全不育。睾丸组织形态学观察显示:Pnldc1纯合敲除小鼠出现混合精子发生障碍:一部分生精细胞阻滞于减数分裂期,另一部分生精细胞阻滞于精子变形阶段。生理状态下,生精细胞中的转座子受到piRNA调控而处于沉默状态。转座子的异常激活往往提示piRNA生成出现障碍。对Pnldc1纯合敲除小鼠生精细胞中反转录转座子LINE1的表达情况进行检测,发现LINE1在生精细胞中异常高表达,提示Pnldc1纯合敲除小鼠生精细胞中piRNA生成存在异常。我们遂对Pnldc1敲除小鼠生精细胞中piRNA通路相关蛋白的表达情况进行了分析,发现敲除鼠中MILI、MIWI、TDRD1以及TDRKH的定位出现了异常极化。线粒体及线粒体间致密物(IMC)与piRNA生成过程关系密切,许多piRNA通路相关基因敲除后,都将影响IMC的形成及线粒体在生精细胞中的分布。透射电镜观察发现,Pnldc1敲除后小鼠精母细胞中IMC可以形成,但线粒体的分布出现极化。我们进一步探究敲除Pnldc1对piRNA生成的影响。首先,我们借助长链RNA测序数据对Pnldc1敲除鼠中piRNA长链前体进行定量。定量结果显示,Pnldc1敲除不影响piRNA长链前体的表达。接着,小RNA测序分析发现Pnldc1敲除后piRNA中间体产生不受影响,而其3’末端核酸外切过程出现障碍。综上所述:小鼠Pnldc1不影响piRNA长链前体及中间体的产生,主要参与piRNA中间体3’末端截短过程,影响piRNA的成熟。Pnldc1敲除后,3’端延长的piRNA转座子沉默能力发生障碍,反转录转座子LINE1异常激活,生精细胞基因组完整性受到破坏。同时,piRNA 3’端延长后,其对基因表达的调控能力发生改变,Pnldc1敲除鼠生精细胞中编码蛋白基因表达出现紊乱,最终导致精子发生障碍和雄性不育。
【图文】：

PNLDC1及PARN多物种序列相似性分析。红线标出的是小酸酶结构域，蓝线标出的是小鼠 PNLDC1 蛋白可能存在的跨蚕、人类、小鼠等物种中均有表达，且具有较高的保守性白 PARN 在线虫和果蝇中表达。黄色表示在上述各物种间均色、绿色表示不全保守，无色表示均不保守。1 的 mRNA 在成年小鼠主要脏器中的表达模式周龄 C57BL/6 雄性小鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、肌 巢 、 睾 丸 ） 抽 提 总 RNA, 逆 转 录 为 cDNA 。ww.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中查询到小鼠 Pnldc1 存在多性针对小鼠 Pnldc1 并可同时识别多个转录本的引物进行 qnldc1 mRNA 在成年小鼠主要脏器中的表达情况。实验结果显成年小鼠睾丸组织中特异性表达（图 2）。这一结果与已有的关的报道相一致[40, 41]。

针对小鼠 Pnldc1 且可同时识别多个转录本的引物进行 qPnldc1 mRNA 在各周龄小鼠睾丸组织中的表达情况。Pnldc龄的小鼠睾丸中即可检测到，，随后在 2 周龄、3 周龄持续现下降。在小鼠睾丸的发育过程中，出生后 1 周到 3 周分化为圆形精子的时期，4 周到 5 周为第一波长形精子出示 Pnldc1 mRNA 在精原细胞、精母细胞及圆形精子中表一结果，我们应用 STA-PUT 重力沉降法分离出 8 周龄小细胞（pachytene spermatocyte, pacSC）以及圆形精子（roun用体外培养分离出小鼠精原干细胞（spermatogonial stem 细胞的总 RNA, 逆转录为 cDNA，检测 Pnldc1 mRNA 在情况。实验结果与各周龄表达模式基本一致（图 4）。综 mRNA 在精原细胞、精母细胞及圆形精子中表达。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R698.2;R-332

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本文编号：2708129